Résistance des bactéries aux antibiotiques P Berche
La résistance des bactéries aux antibiotiques
Une souche bactérienne est dite résistante à un antibiotique quand elle est capable de se développer en présence d'une concentration élevée d'antibiotique.
La résistance bactérienne aux antibiotiques On distingue : La résistance naturelle ou " innée" - Espèces bactériennes qui sont naturellement résistantes à certains antibiotiques. Cible absente : ß-lactamines et mycoplasmes. Cible peu accessible: bactéries à Gram négatif et macrolides. Cible non-affine : bactéries à Gram positif et acide nalidixique). La résistance acquise : Résistance qui apparaît chez des bactéries jusqu'alors sensibles aux antibiotiques. Correspond à une adaptation des bactéries aux antibiotiques.
La résistance des bactéries aux antibiotiques
Mécanismes de la résistance des bactéries aux antibiotiques Enzymes inactivatrices Imperméabilité porines
Modifications des cibles PBP Ribosomes Gyrases RNA polymérases
Pompes d’efflux
La résistance des bactéries aux β-lactamines
Bactéries incubées avec des ß-lactames Control
Cefotaxime 2 h incubation
Amoxcilline 2 h incubation
Comment les β-lactamines agissent?
• les pénicillines et les céphalosporines • mode d'action de la pénicilline G
N-acétyl-neuranique
N-acétylglucosamine
Transglycosylases
Transpeptidases
Peptidoglycane
Carboxypeptidases
(M) (G) Autolysines
+
Les PBPs ( penicillin-binding proteins) 5-8 PBPs par espèce bactérienne jouent un rôle majeur dans la synthèse du peptidoglycane, PM 40-120Kda. Transpeptidases: dipeptide Dala- Dala, branchement des chaînes pentapeptidiques Transglycosylases: élongation des chaînes polyosidiques (N-acétylneuramique, N-acétyl-glucosamine) Carboxypeptidases : hydrolyse des chaînes polyosidiques
Mise en évidence des PBPs : affinité pour la pénicilline G CMI mg/L 0.125 0.125
4
4
2
4
1
1
1
La pénicilline G inhibent les transpeptidases
• inhibition de la synthèse du peptidoglycane entraînant la lyse bactérienne (autolysine) • homologie : Dala-Dala –cycle ß-lactame • pénicilloylation des PBPs (sérine-tranférase): liaison covalente PBP-sérine avec la pénicilline.
Noyau péname S R
CO
NH
Cycle thiazoline
Cycle β-lactame
CH 3 CH 3
N O
COOH
Acide 6 amino-pénicillanique
Penicillium notatum
H Acide 6 aminopénicillanique Benzylpénicilline Méthicilline Ampicilline Amoxicilline Carbénicilline Ticarcilline Cloxacilline
R
Pipéracilline
Chaînes latérales Azlocilline
R’ Acide clavulanique
Thiénamycine
Imipenème Nocardicine A
Azthréoname
Mécilliname
Moxalactame
Noyau céphème 1 S R' CO
HN
7
Cycle Dihydrothiazine
Cycle β-lactame
N O
2
6
5
3 4
R
COOH acide 7 amino-céphalosporanique
Cephalosporium acremonium
Céphalosporines R Chaînes latérales
R’ Acide 7 aminocéphalosporanique
H
R
R’ Cefotaxime
Cephalotine Cefuroxime Cephaloridine Cephaloglycine Cephalexine
Ceftazidime
Cefsulodine
Cefoxitime Cefamandole
Cefopérazone
Mécanismes de la résistance bactériennes aux ß-lactames
Modifications des PBPs
ß-lactamases
PBPs cibles
Antibiotiques
Mécanismes Cibles PBPs
ß-lactamases
Imperméabilité
Bactéries à Gram +
Bactéries à Gram -
+++
+
S aureus S pneumoniae entérocoques
P aeruginosa Neisseria H influenzae
+
+++
S aureus E faecalis
Entérobactéries +++ P aeruginosa +++ Neisseria H influenzae
-
++ Entérobactéries P aeruginosa
Résistance par production de β-lactamases
Noyau péname S R
CO
NH
Cycle
Cycle thiazoline
β-lactame
CH 3 CH 3
N O
COOH β-lactamases
mode d'action de β-lactamases : ouverture du cycle β-lactame (homologie avec les PBPs)
Résistance par production de β-lactamases
• résistance très répandue chez les bactéries à Gram +, à Gram- (mycobactéries) • caractérisation des β-lactamases PM, PI, profils de substrat (pénicillinases,cépalosporinases) Profils d'inhibition (acide clavulanique) inductibles ou constitutives, séquences peptidiques (PBPs) localisation génétique : chromosomes, plasmides, transposons
Résistance par production de β-lactamases
2 groupes principaux les pénicillinases : pénicilline G >> céphalosporines (inhibées par l'acide clavulanique) les céphalosporinases : céphalosporines >> pénicilline G (non inhibées par l'acide clavulanique)
Les pénicillinases PM 30-40 kDa Affinité pénicilline G, ampicilline >> céphalosporine Inhibition par l'acide clavulanique
Les pénicillinases chromosomiques
Spécifiques de certaines espèces (Klebsiella pneumoniae, Citrobacter diversus)
Phénotype résistant à pénicilline G et ampicilline (ticarcilline, pipéracilline) et sensible aux céphalosporines de 1ère génération (C1G), C2G et C3G
Les pénicillinases plasmidiques
Très hétérogènes, non spécifiques d'espèce Les pénicillinases à large spectre TEM-1 et TEM-2 (Gly 39 vs Lys 39): E.coli , P mirabilis SHV-1: K pneumoniae et entérobactéries PSE-1, PSE-2, PSE-3 : P aeruginosa
Les pénicillinases plasmidiques Les pénicillinases à spectre élargi dérivées de TEM et SHV par mutations: TEM3 →TEM 26 ; SHV2→SHV 5 Inhibées par l'acide clavulanique Résistance à pénicilline G, ampicilline, C1G, C2G = C3G Sensibilité à l’ imipénème TEM-2 TEM-3 102 Glu
Lys
236 Gly
Ser
Évolution de la ß-lactamase TEM-1 selon l'affinité et la localisation de la substitution d'acide aminé au niveau du site actif de l'enzyme ß-lactamase à spectre étendu (BSE) Affinité augmentée Km diminue Vmax augmente
ß-lactamase à large spectre
164
104
238
240
TEM-3, TEM-10, TEM-12
TEM-1 TEM-2 Site actif en position 70
ß-lactamase TRI ou IRT 69 Affinité diminuée Km augmente Vmax diminue
244
TEM-30, TEM-31, TEM-45
Les céphalosporinases
les céphalosporinases sont chromosomiques Hydrolyse de la céfalotine >> pénicilline Non inhibée par l’acide clavulanique Codées par le gène ampC Inductibles ( Enterobacter cloacae, Citrobacter)
Céphalosporinase Phénotype de haut niveau d’induction amoxicilline, amox-clav, C1G et C3G
Mutations ponctuelles AmpR
AmpC
+ β-lactamine Phénotype de bas niveau d’induction : amoxicilline, amox-clav, C1G
AmpD
Induction et contrôle du gène ampC -Le gène ampR : activateur transcriptionnel en présence de βlactamine - Le gène ampD , répresseur de ampC, mutations ampC entrainant la surproduction de céphalosporinase ( dite déréprimée) Phénotypes de résistance Bas niveau d’induction ( AmpR) : résistance à amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, C1G Haut niveau d’induction ( AmpD ) : résistance identique + C3G, sauf imipenème et cefpirome
Résistance aux β-lactamines par modifications de la cible: les PBPs
Résistance de Staphylococcus aureus à la méthicilline
Résistance de S. aureus à la méthicilline
Historique 1941 sensible à la pénicilline G 1944 pénicillinase 1960 résistance à la méthicilline 1995 95% de souches pénicillinases 25% souches méthicilline R (multiples résistances associées: aminosides...)
Résistance de S. aureus à la méthicilline
La résistance à la méthicilline • résistance à toutes les pénicillines et céphalosporines • le gène mecA codant pour PBP-2a (78 kDa) • synthèse d'un nouveau peptidoglycane • porté par 1 transposon (localisation chromosomique) • origine : PBP5-PBP3 Enterococcus hiriae
femAB
femE
femC Chromosome de S. aureus
femF
femD mec his pur nov
mecl-mecR1 mecA Tn554 ermA
IS
IS
pUB110 aad
Résistance de Streptococcus pneumoniae à la pénicilline Souches sensibles concentration minimale inhibitrice CMI 75% Paris)
Mécanismes de la résistance de S. pneumoniae à la pénicilline
- Altérations des PBPs : 5 PBPs chez S. pneumoniae, les plus souvent modifiées sont les PBP-1a, PBP-2b , PBP-2x - Résistance chromosomique par transformation - Gènes pbp mosaïques
R
S
R
R
S
Transformation
S
R
gènes mosaïques pbp-2b de souches pénicillinerésistantes de S. pneumoniae
N° de substitutions nucleotidiques du gène pbp2b (1453bp)
•
isolats sensibles 0.6%
•
isolats résistants 14-20%
domaine transpeptidase PBP 2B a Ser b
Classe A
c d e f g h codons bp 0
Classe B 0 300
100 600
200 900
300
400
500
600
679
1200 1500 1800 2100 2300
Pool de gènes pbp de streptocoques oraux S. mitis, S. sanguis, S.oralis Réservoir de gènes pbp résistants à la pénicilline provenant d’espèces de Streptocoques commensaux Contacts intimes entre espèces compétentes et S. pneumoniae , multiple transferts horizontaux in vivo de gènes pbp par transformation
Transformation
S mutations
R
R
Résistance aux ß-lactamines par imperméabilité
La résistance aux ß-lactamines par imperméabilité
La membrane externe des bactéries à gram négatif
- bicouche lipidique hydrophobe (LPS) difficile à franchir pour les molécules hydrophiles (ß-lactamines) - les porines: structure trimérique (30-40 Kda) OmpC, OmpF, Pho E
Mécanismes de la résistance aux ß-lactamines par imperméabilité
Le passage d'une ß-lactamine est fonction de sa taille (< 600), de son hydrophobicité et de sa charge électrique Altérations des porines - Diminution quantitative d'une ou plusieurs porines - modification de la structure d'une des porines essentielles ou du LPS. Résistance croisée aux autres antibiotiques : chloramphénicol, quinolones, tétracyclines
Conclusion Dans certaines souches multi-résistantes , tous les mécanismes de résistance aux β-lactames peuvent se coexister (surtout chez les bactéries à Gram +) .
Peptidoglycane Pénicilline Vancomycine Fosfomycine
Ribosomes Macrolides aminosides Tétracyclines chloramphénicol
Enzymes cytoplasmiques
ADN
Biosynthèses des aminoacides et des nucléotides
Gyrases, RNA polymérases
Sulfamides triméthoprime
Rifampicine quinolones
Glycopeptides Structure of glycopeptides : la vancomycine OH H2 N H3 C
O H
O OH
Cl
O CH3
CH 3 OH Cl
O
HO
OH O
O O
HN
N H
HO
O O
C
O
H N
N H
H N CH2 C O NH2
OH OH
CH3
O O
N H
NH2 CH2
CH CH3 CH3
Glycopeptides
•
teichoplanine OH CH O H 2 Cl
NH O
O
Cl O
CH2 O H OH
O
O
HNCO 3 H O HN O
OH H N
O N H
O O
N H
H
O
O O
OH CH O O H 2 OH HO OH
HO
NH
3
N H
O
C
HO
O
H
OH
Mécanismes d’action des antibiotiques: glycopeptides
Les glycopeptides sont actifs contre les bactéries Gram + Inactifs contre les bactéries à Gram - , car ils ne peuvent traverser l’enveloppe externe Les glycopeptides inhibent la synthèse du glycopeptide: par liaison avec la portion D ala-D ala de l’ UDP-muramyl pentapeptide après son transfert dans le cytoplasme bactérien Cette liaison inhibe la transpeptidation et la transglycosylation
cytoplasme pyruvate
D-Lac
Ala racemase
-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Lac carboxypeptidase
D-Ala Van A ATP
D-Ala-DLac D-Ala-D-Ala adding UDP- -L-Ala-D-Glu-L-Lys enzyme ATP
UDP Lac
Paroi peptidoglycane
L-Ala
VanH NADH
membrane
-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-DLac
transpeptidase
-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-DLac -L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-DLac transglycosidase
L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-Dpentapeptide
L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-DLac
vancomycin : N-acetylmuramic acid: N-acetlyglucosamine
: undecaprenyl lipid carrier
Résistance aux glycopeptides Décrite en 1988 chez les entérocoques (Enterococcus) Associé à deux phénotypes de résistance vanA : confère un haut niveau de résistance inductible à la vancomycine et à la teicoplanine; l’opéron vanA est porté par un transposon ( Tn1546) vanB : confère une résistance inductible de niveau variable à la vancomycine mais pas à la teicoplanine ; l’opéron vanB gene est porté par un grand élément conjugatif (>100 kb) Actuellement largement répandue chez les entérocoques et constitue un problème nosocomial majeur
Les différents types de résistance acquise aux glycopeptides chez les entérocoques
VanA
VanB
CMI vancomycine CMI téicoplanine Expression inductible Support génétique
> 64 > 16 inductible
4-1000 0,5-2 inductible
Extrémité cible
D-Ala - D-Lac
D-Ala - D-Lac
D-Ala - D-Lac
Espèce
Enterococcus spp.
E. faecium E. faecalis E. casseliflavus
E. faecium E. faecalis E. faecalis
Tn1546
Tn1547 Tn1549 Tn5382
VanD 64 4-16 constitutive chrom
VanE 16 0,5
chrom
D-Ala -D-Ser
Aminoglycosides NH2 NH NH NH2 NH
C NH
HO
OH CH2 R2
HO HO
NH O
H3 C
NH2
R1
NH2
NH NH NH
HO
R6 O
R O OH O CH3 HN
R5
NH 2
O
NH O
HO
R4 R5
R7
R6
O
NH-R
R8
R4
HO
NH2
O
OH
O
O O
NH2
NH-R9 R3
O
HO
NH- R1
O HO
OH OH
streptomycine
néomycine, paraneomycine, lividomycine
kanamycine, amikacine, gentamicine, tobramycine, netilmicine
OH R2
Aminoglycosides Antibiotiques bactéricides inhibent la synthèse protéique interagissent avec un ou plusieurs sites ribosomaux Interagissent avec des protéines appartenant à la petite sous-unité ribosomale 30S (S3, S4, S5, and S12) Les conséquences de l’interactions ribosomes- aminosides : inhibition de la synthèse protéique Des erreurs de lecture du code génétique Résistance par inactivation enzymatique (plasmides ou transposons) Résistance par modification de la cible (mutations chromosomiques de protéines ribosomiques) phénomène rare.
Résistance enzymatique aux aminoglycosides AAC(6')
CH2-NH2
AAC(3)
HO ANT(4')(4")
APH(3')
NH
HO AAC(2')
HO
NH2
O O
O APH(2') ANT(2")
HO
NH-R9 R3
ANT(4')(4")
OH NH2
R2
Des enzymes inactivent les aminoglycosides en ajoutant des groupes - phosphoryl (phosphotransférases APH) - adényl (nucléotidyl tranférases ANT) - acétyl (acétyltransférases AAC) Differentes enzymes modifient chaque antibiotique à des groupes aminés ou hydroxyl
Macrolides érythromycine, oléandomycine, roxithromycine, clarithromycine CH
R2
CH
3 R 1
O
O O
H C 3 HO
CH R
H C 3
O R
3
R
4
OH
josamycine, midécamycine, spiramycine CH
3
N
R2 CH CH
CHO
CH O O
3 3
3
O
5
CH
3
O
OH
OCH CO
3 R
3 O N
CH CH
R
1
3 3
3
3
O
CH
3
O
Les macrolides sont bactériostatiques pour la plupart des antibiotiques et bactéricides pour certaines bactéries à Gram positif Inhibent la synthèse protéique Interagissent avec la sous-unité ribosomale 50S Inhibent l’élongation des protéines par la peptidyltransférase prévient la translocation du ribosome
Mécanismes de la résistance aux MacrolidesLincosamines-Synergistines (MLS) chez les cocci à Gram +
3 mécanismes principaux
Mutations •ARNr 23S •protéines ribosomales ⌫ gène ery A, ery B, ery C
Méthylases ⌫ gènes erm •résidu Adénine (A2058) •Résistance croisée MLS •phénotype MLSb constitutif •phénotype MLSb inductible •fréquemment sur des éléments génétiques mobiles
Efflux ⌫ gènes mef •phénotype M •chromosomique
Mécanismes de la résistance aux MLS chez les cocci à Gram + •Phénotype MLSb constitutif : •Erythromycine R (CMI >128 mg/l) •Clindamycine, Lincomicine R (CMI >128 mg/l) •Pristinamycine I/S (CMI 0,5 mg/l) •Phénotype MLSb inductible : •Erythromycine R (CMI >128 mg/l) •Clindamycine, Lincomicine S (CMI < 0,25 mg/l) •Pristinamycine S (CMI < 0,25 mg/l) • Résistance de bas niveau par un mécanisme d’efflux •(mefE) (CMI = 4-16 mg/L) •Erythromycine R (CMI 1-8 mg/l) •Clindamycine, Lincomicine S (CMI 0,125 mg/l) •Pristinamycine S (CMI 0,5 mg/l
Tétracyclines tétracycline, doxycycline, minocycline R1
OH
R2
O
N
R3
OH
OH
CH3 CH 3 OH C
O
O NH-R4
Bactériostatiques Inhibent la synthèse des protéines Interagissent avec la sous-unité ribosomale 30S Entraînent une distortion du site A du ribosome et prévient l’alignement des aminoacyl tRNA avec le codon approprié du mRNA
Résistance aux tétracyclines
Mécanisme d’efflux : gènes codant pour des protéines de membrane tetA à tetG chez les Gram tetL and tetK chez les Gram + Protection du ribosome : gènes codant pour des protéines cytoplamiques protégeant le ribosome tetM à tetT essentiellement chez les Gram +
Chloramphénicol O = C -CHCl 2 NH R
CHOH - CH – CH- OH 2
Bactériostatique Inhibe la synthèse protéique Interagit avec la sous-unité ribosomale 50S - prévient l’attachement de l’extrémité de l’aminoacyl tRNA à son site de liaison
Résistance au chloramphénicol
La chloramphénicol acétyl-transférase (CAT) Enzyme codée par un plasmide inactivant le chloramphénicol Mécanisme majeur de résistance des bactéries à Gram + et à Gram enzymes inductibles chez les Gram +, constitutives chez les Gram Les dérivés acétoxy du chloramphénicol ne peuvent plus se lier aux ribosomes
Quinolones acide nalidixique (1ère génération)
norfloxacine (2ème génération) O
O COOH
X Y
N R
HN
N
F cibles : les topoisomérases type 2 (DNA gyrase A) type 4
COOH
Y
N R
Résistance aux quinolones Mutations chromosomiques gènes gyrA et gyrB Modifications de la topoisomérase IV Imperméabilité
Efflux
Sulfamides et triméthoprime Sulfamide
Triméthoprime H
SO2
N R
N
H2 N
OCH 3 OCH 3
N
NH
NH 2
2
OCH 3
Les sulfamides inhibent les enzymes impliqués dans la production d’acide tétrahydrofolique (THFA), cofacteur essentiel à la synthèse des acides aminés (sérine, méthionine) et des bases puriques et pyrimidiques.
Sulfamides et triméthoprime Sulfamide
Triméthoprime H
SO2
N R
N
H2 N
OCH 3 OCH 3
N
NH
NH 2
2
OCH 3
Les sulfamides sont des analogues structuraux de l’acide para-aminobenzoique (PABA), qui est le substrat de la première enzyme de la voie de synthèse de l’acide folique Le trimethoprime (TMP) est structuralement similaire à la dihydrofolate réductase (DHFR) ( dernière étape de la synthèse) et agit comme un inhibiteur compétitif de la DHFR
Dérivé de la dihydroptérine
acide p-aminobenzoique H Dihydroptéroate synthétase
SO2N R
Acide dihydroptéroïque Sulfamide NH2 Acide dihydrofolique
Tétrahydrofolate réductase
Acide tétrahydrofolique
N
H N N
OCH OCH
OCH NH Triméthoprime
Rifampicine CH
3
CH
3
HO CH CH CH
3
3
3
COO
OH CH
CH O 3
O
OH
CH
OH
3
NH
3
R
O O
OH CH
3
O
Inhibition de la synthèse des RNA La cible de la rifampicine : la sous-unité ß de l’ARN polymérase Résistance par mutations chromosomiques à haute fréquence (1/105-106)
