Biosynthèse et Tri des Protéines
Biosynthèse et Tri des Protéines Synthèse protéique par 2 types de ribosomes: - Libres: Prot solubles Prot organites (Noyau, Mito, Chloro, Peroxysome) Prot mbp face cytosolique - Associés au RE: Prot de la mbp (TM ou face MEC) Prot sécrétées (MEC) Prot Golgi et Lysosome
Ribosome ⇒ réticulum endoplasm. ⇒ Golgi ⇒ vésicule sécrétoire ⇒ milieu extracellulaire.
Biosynthèse et Tri des Protéines
Transport antérograde
Transport rétrograde
Comment la cellule cible les protéines ? Nécessité d’un système de tri des protéines du RE vers le compartiment cible 2 types de transport: - Au cours de la synthèse (co-traductionnelle) - Après la synthèse (post-traductionnelle)
Importation Co-traductionnelle
Expérience : Protéase Détergent
(-) microsomes
(+) microsomes
Les protéines transloquées sont plus courtes
Importation Co-traductionnelle
Importation Co-traductionnelle Synthèse protéique en système acellulaire en absence de microsome
Synthèse protéique en système acellulaire en présence de microsome
Mécanisme général de la translocation co-traductionnelle
Les signaux peptidiques d’adressage vers le RE Les signaux clivables (en N-term) Günter Blobel 1999 Peptide signal : - Alternance d’aa hydrophobes et aa acides - Positionné en N-term - Permet l’ouverture du canal aqueux du translocon - Translocation à travers la bicouche lipidique - Éliminé après translocation
La reconnaissance des signaux de transfert Intervention du complexe SRP (Signal Recognition Particle) -
Liaison de SRP à la séquence signal et arrêt de la synthèse protéique Fixation du ribosome à la membrane du RE Fixation du complexe SRP-ribosome au récepteur de la SRP Rapprochement du complexe vers un translocateur (complexe Sec61) En fin de positionnement, la SRP se détache du peptide signal, la synthèse de la protéine redémarre et la chaîne peptidique naissante s’insère dans la lumière du translocon dont l’extrémité cytosolique est obturée par la grosse sous unité ribosomale - Libération de SRP de son récepteur - La fixation du peptide signal sur un site spécifique du translocon est responsable de l’ouverture de ce pore du côté luminal - Translocation de la chaîne protéique naissante à travers la membrane du RE grâce à l’allongement de la chaîne protéique en cours de synthèse, et à des molécules chaperonnes localisées dans la lumière du RE, en particulier la BiP (Binding Protein), qui "tirent" le peptide en cours de synthèse.
Cycle de la SRP L’insertion co-traductionnelle de la protéine est commandée par des échanges GTP-GDP et l’hydrolyse du GTP
Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE
La reconnaissance des signaux de transfert 1) Signal-Recognition Particle (SRP) - Ribonucléo-protéine cytosolique - GTPase - Composé d’un ARN de 300 nucléotides - p54 interagit avec une sous unité du récepteur SRP pour hydrolyser le GTP et permet de lier la séquence signal au RE - p9 et p14 interagissent avec le ribosome - p68 et p72 sont nécessaire à la translocation de la protéine 2) Récepteur de la SRP - Protéine TM (sous unité α & β) - La p54 de la SRP interagit avec la sous unité α liée au GTP 3) BiP - Protéine chaperonne de la famille des HSP 70 - Possède un domaine de liaison aux peptides et un domaine ATPase - Se lie et stabilise les protéines en cours de translocation (maintien de la structure compétente déroulée)
Le canal de translocation: Translocon 1) Composition minimale du Translocon: 4 protéines TM nécessaires : - Sec 61α - Sec 61β - Sec 61γ - TRAM: Translocation – associated membrane protein Requise pour la translocation ou l’intégration dans les membranes
2) Protéines associées au translocon : Permanentes: - Signal Peptidase: clive le peptide signal - OligoSaccharide Transférase: assure les N-glycosylation (N… -Asn-X-S/T-…C) Transitoires: - SRP Receptor - Calnexine: prot membranaire, rôle de chaperonne pendant le repliement - prot solubles de la lumière du RE : claréticuline, disulfide isomérase, BIP,… - SR : récepteur de SRP, n’est associé au TC que pour accrocher le ribosome. - BIP (Binding Protein) : chaperonne pour les protéines transloquées
La voie sécrétoire: protéines sécrétées
Les signaux non clivables (internes) Comment une protéine transmembranaire à passage unique avec une séquence signal du RE clivable est intégrée dans la membrane du RE ?
- Initiation de la translocation cotraductionnelle par une SS Nt (rouge) qui a la fonction de seq de début de transfert = start-transfer signal - L’interaction de la sequence stoptransfert (orange) avec son site de liaison declanche un changement de conformation du translocon ⇒ libère la protéine latéralement dans la bicouche lipidique
Les signaux non clivables (internes) - Permet l’insertion des polypeptides dans la membrane - Trois modèles d'insertion d'une protéine transmembranaire à un passage dans la membrane du RE Type I Type II Type III
Les signaux non clivables (internes) -
L’orientation du signal d’ancrage est déterminé par la distribution des charges à proximité de la région hydrophobe
-
Les résidus basiques sont plus abondants côté cytoplasmique et résidus acides côté lumière
Synthèse et insertion dans la membrane du RE des protéines à un passage membranaire de Type 1 - Séquence signal N-terminal clivable (SS), - Séquence stop-transfert en position C-terminal - La majorité de la protéine est face luminale
Synthèse et insertion dans la membrane du RE des protéines à un passage membranaire Type 2
- Pas de SS clivable, séquence stop-transfert - Séquence start-transfert en position N- terminal - Charge (+) N-terminal à côté du domaine hydrophobe - Séquence signal-Ancrage interne unique dirige l’insertion de la protéine
Synthèse et insertion dans la membrane du RE des protéines à un passage membranaire Type 3 Pas de SS clivable, séquence stop-transfert, flanquée de résidus chargés + à l’extrémité Ct Orientation similaire aux protéines de type I, souvent chargée (+) à l’ext Ct La teneur élevée en acides aminées chargés (+) à l’une des extrémités de la séquence d’ancrage déterminera l’orientation de l’insertion
Insertion dans la membrane du RE des protéines à 2 passages membranaire
- SS vers le RE agit comme séquence début de transfert (start-transfer) et initie le transfert de l’extrémité Ct - Après passage de la séquence stop transfert dans le translocon, ce dernier la libère latéralement dans la membrane
Synthèse et insertion dans la membrane du RE des protéines à plusieurs passages membranaire Type 4-1 - Séquence Nt cytosolique ⇒ SS-ancrage, Stop transfert, SS-ancrage, Stop transfert, SS-ancrage, Stop transfert,
Synthèse et insertion dans la membrane du RE des protéines à plusieurs passages membranaire Type 4-2 - Séquence Nt luminale ⇒ SS-ancrage, SS-ancrage, Stop transfert, SS-ancrage, Stop transfert, SS-ancrage, Stop transfert,
Importation post-traductionnelle dans le RE
- Protéines de 60 à70 aa (y compris la SS) - Protéines de haut PM à condition que: Présence d’ATP Présence de Hsp70 qui maintien la protéine dans une forme linéaire compétente
Rétention des protéines dans le RE Protéines résidentes du RE-Protéines de la mb du RE Protéines résidentes ou solubles Marquées par une séquence signal: Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) en Ct - Export du RE vers Golgi - Reconnues par un récepteur - Retour sélectif vers le RE
Rôle de la rétention: Maturation Formation des S-S, 1ere étapes de glycosylation, clivage protéolytique spécifique, structuration correcte, oligomérisation Protéines mb du RE Motif DiLys Ct: Lys-Lys-X-X
Rétention des protéines dans le Golgi
- En majorité des protéines de Type 2 qui ont un rôle dans la glycosylation - Le signal de rétention est associé au segment transmembranaire
Le transport vésiculaire Différents types de vésicules: Vésicules entourées de protéines: - CopI: cis-Golgi vers REG - CopII: REG vers cis-Golgi - Clathrine: mb plasmique et trans-Golgi
Séquence Signal
Protéines
Récepteur du signal
Vésicules qui incorporent la protéine portant la signal
Signal de sortie luminale Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL)
Mannose 6-P (M6P)
Protéines solubles résidentes du RE
Récepteur KDEL dans la mb du Golgicis
COP-I
Enzymes solubles lysosomales
Récepteur au M6P dans la mb du Golgi trans
Clathrine/AP1
Enzymes lysosomales secrétées
Récepteur au M6p dans la mbp
Clathrine/AP2
Signal de sortie cytoplasmique Lys-Lys-X-X (KKXX) Di-Arg (X-Arg-Arg-X) Di-acide (ex: Asp-X-Glu)
Tyr-X-X-Φ (YXXΦ) Leu-Leu (LL)
Protéines résidentes de la mb du RE
COP-I
COP-I
Protéines cargo dans le RE
COP-II
COP-II
Protéines de la mb trans Golgi
AP1
Clathrine/AP1
Mbp
AP2
Clathrine/AP2
Mbp
AP2
Clathrine/AP2
Modification co et post traductionnelle
Modification co et post traductionnelle N-glycosylation
Séquence consensus Asn-X-Ser/Thr X≠Cys et Pro
N-glycosylation: oligossaccharide associé au Dolichol-Phosphate dans la BL du RE
N-glycosylation: Maturation dans le RE et le Golgi
Ciblage du lysosome : Synthèse du marqueur M6P sur une hydrolase lysosomale - 1ère étape : spécifiquement activé par un signal patch présent sur l'hydrolase lysosomale - 2ème étape : non spécifique, se fait dans le cis Golgi ⇒ protège ces mannoses des mannosidases du médian Golgi
GlcNac Phosphotransferase
GlcNac Phosphoglycosidase
Les deux types de signaux de tri dans une protéine (A) Séquence signal (B) Signal patch
Pourquoi le M6P n’est-il ajouté que sur les hydrolases à destination lysosomale - Reconnaissance de l'hydrolase par l'enzyme golgienne qui ajoute le M6P - Or toutes les glycoprotéines qui quittent le RE ont les mêmes chaines N-liées - Le signal est ailleurs ⇒ C'est un signal patch
Ciblage du lysosome : le mannose-6-phosphate
Ciblage du lysosome : le mannose-6-phosphate
Pathologies lysosomales
Canal de translocation de la membrane mitochondriale
- OXA: insertion des protéines de la mb int synthétisées dans la mitochondrie. Permet l’insertion de protéines importantes dans la mb int qui ont d’abord transloquées dans la matrice par les autres complexes
- TOM (translocon of the outer membrane) : importation des protéines mitochondriales codées par le noyau Permet l’insertion des protéines membranaires dans la mb ext - SAM: permet la translocation et le positionnement correct des protéines en feuillet β (abondantes dans la mb ext) Ces protéines transloquent à travers TOM puis SAM - TIM23 (translocon of the inner membrane): contient une extension à la mb ext sous forme d’hélice α hydrophobe ⇒ traverse simultanément les 2 membranes transport de certaines protéines solubles dans la matrice et permet l’insertion des protéines TM dans la mb int - TIM22: insertion de certaines protéines dans la mb int, ex: protéines de transport de l’ADP, ATP et phosphate int et/ou ext de la mito
Importation mitochondriale
Pour une protéine de la matrice, transport à travers 2 membranes; - Reconnaissance de la SS Nt par le récepteur du complexe TOM - Translocation à travers le complexe TIM23 ⇒ La protéine traverse de manière transitoire les 2 membranes - Clivage de la séquence signal
Importation mitochondriale: rôle de l’énergie
- Libération de la Hsp70 cytosolique de la protéine dépend de l’hydrolyse d’ATP - Après insertion initiale de la SS et de la portion de peptide adjacente dans le complexe TOM, la SS interagit avec le complexe TIM - Translocation de la SS dans la matrice mitochondriale dépend du potentiel de mb de la mb int - La Hsp70 Mitochondriale se lie à la protéine en cours de translocation
Importation dans la membrane interne mitochondriale (I)
- La SS Nt (rouge) initie l’import dans la matrice - La séquence hydrophobe (orange) qui suit la SS se lie à TIM23 dans la mb int et stoppe la translocation - Le reste de la protéine est Le reste de la protéine est tirée dans l’espace inter membranaire à travers le complexe TOM de la mb ext - La séquence hydrophobe reste encré dans la mb int
Importation dans la membrane interne mitochondriale (II)
- Libération complète de la protéine dans la matrice mitochondriale - Clivage de la SS (rouge) permet d’exposer la séquence hydrophobe adjacente (orange) à l’extrémité Nt - Ce signal dirige la protéine vers la mb int en utilisant la voie OXA-dépendante (qui permet l’insertion des protéines codées par le génome mitochondrial)
Importation dans la membrane interne mitochondriale (III)
(C) Certaines protéines solubles de l’espace inter membranaire transloquent vers la mb int selon le même processus - Libération dans l’espace inter membranaire grâce une signal peptidase qui clive la séquence signal hydrophobe membranaire (orange) (D) Les protéines de transport contiennent des SS internes - Ces protéines traversent le complexe TOM en boucle - Association aux protéines chaperonnes dans l’espace inter membranaire qui guident la protéine vers le complexe TIM22 - Le complexe TIM22 est spécialisé dans l’insertion de protéines à passage multiple dans la mb int
Importation mitochondriale Détermination du % d’importation
Protéine chimère: - DHFR (dihydroxyfolate réductase) prot cytosolique + SS de l’alcool deshydrogénase (lumière mito) - En présence de methotrexane (inhibiteur de la DHFR) qui se lie au site actif de la DHFR et empèche la protéine de se dérouler: pas de translocation - La forme déroulée transloque - Nécéssité d’une forme déroulée compétente pour la translocation
Importation dans le chloroplaste
Les chloroplastes possèdent : - Le complexe Toc : 2 récepteurs (Toc159 et Toc34), une protéine canal (Toc75) et un composant périphérique (Toc64) - Le complexe Tic: Tic22, Tic110, Tic40, Tic20, Tic21 Tic62, Tic55 et Tic32 - Les peptides signaux des protéines importées dans le chloroplaste sont reconnus par plusieurs protéines cytosoliques : Hsp70 et Hsp90
Contrôle du repliement et sortie du RE Rôle de la Calnexin
Elimination des protéines mal repliées
Les protéines mal repliées transloquent dans le cytosol Déglycosylation, ubiquitination et dégradation dans le protéasome
Elimination des protéines mal repliées L'ubiquitination: - Modification post-traductionnelle - Fixation covalente d‘ubiquitine (8 kDa) sur une ou plusieurs Lys de la protéine substrat - Rôle: plus connue est la dégradation de la protéine ubiquitinée - Il faut 4 ubiquitines pour qu’une protéine soit dégradée Protéasome: - Complexe enzymatique multi protéique - Dans les cellules eucaryotes, ils se trouvent dans le noyau, le cytosol et associés au RE - Fonction principale: dégradation des protéines mal repliées, dénaturées ou obsolètes de manière ciblée
Procaryotes
