Topologie et Dynamique des protéines membranaires Les protéines membranaires: - Protéines intrinsèques Protéines transmembranaires (intégrales) Protéines ancrées: Extraites par l’action de détergents - Protéines extrinsèques (périphériques) Extraites par l’action de solutions à forte concentration en sels (ex: NaCl 5M)

Topologie et Dynamique des protéines membranaires

Topologie et Dynamique des protéines membranaires

Topologie et Dynamique des protéines membranaires

Topologie et Dynamique des protéines membranaires

Polytopiques (1, 2, 3)

Monotopiques (4-8)

Topologie et Dynamique des protéines membranaires Protéines polytopiques - En contact avec les deux faces de la membrane. - Les structures transmembranaires peuvent être: 1 et 2. une ou plusieurs hélices α transmembranaires (de 1 à plus de 20 par protéine). Il s'agit de loin de la conformation transmembranaire la plus observée. 3. un tonneau β transmembranaire composé de 8 à 22 brins β.

Polytopiques (1, 2, 3)

Topologie et Dynamique des protéines membranaires Bactériorhodopsine: R à 7TMS

Porines bactériennes

Polytopiques (1, 2, 3)

Topologie et Dynamique des protéines membranaires Protéines monotopiques: Protéines en contact avec une seule face de la membrane 4. Interaction par une hélices α amphipathique parallèle au plan de la membrane 5. Interaction par liaison covalent avec un lipide membranaire (lipidation): Nacylation N-terminale (liaison à un acide gras) 6. Glipiation C-terminale (liaison à un glycosylphosphatidylinositol- Ancre GPI) 7 et 8. Interaction par liaison électrostatique directe ou indirecte (via un ion calcium) avec des lipides ou proteines membranaires

Monotopiques (4-8)

Topologie et Dynamique des protéines membranaires Protéines monotopiques Prostaglandine H2 synthase-1

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La majorité de leur biomasse est localisée dans le cytosol Elles s’associent avec les membranes par une hélice α amphipatique exposée à la surface de la protéine Permet à une protéine soluble cytosolique” de s’associer avec la surface de la bicouche lipidique par le biais d’interaction hydrophobes

Topologie et Dynamique des protéines membranaires Protéines monotopiques

Cardiotoxine

Modification lipidiques permettant aux protéines de s’encrer à la membrane plasmique Protéines monotopiques

Modification lipidiques permettant aux protéines de s’encrer à la membrane plasmique Protéines monotopiques

Prédiction du caractère physicochimique des segments membranaires des protéines Profil d'hydrophobicité

Prédiction des hélices α transmembranaires Profil d’hydrophobicité de la glycophorine A

Prédiction des hélices α transmembranaires Profil d’hydrophobicité de la glycophorine A

Solubilisation, purification et reconstitution des protéines membranaires Les protéines membranaires: - Protéines intrinsèques Protéines transmembranaires (intégrales) Protéines ancrées: Extraites par l’action de détergents - Protéines extrinsèques (périphériques) Extraites par l’action de solutions à forte concentration en sels (ex: NaCl 5M)

Solubilisation, purification et reconstitution des protéines membranaires Les détergents • Molécules amphiphiles solubles qui disloquent les membranes • Equilibre monomères / micelle Concentration micellaire critique

Principe d’action des détergents

Solubilisation

Purification Analyses structurales

Reconstitution

Analyses fonctionnelles

Purification des protéines • Chromatographie sur colonne: Chromatographie d’affinité Gel filtration Chromatographie échangeuse d’ion HPLC • Electrophorèse: SDS PAGE Electro focalisation Pour la caractérisation structurale: détermination du PM, pHi, séquence, ect....

Diffusion latérale des protéines membranaires

Diffusion latérale des protéines membranaires

Marquage des protéines à la surface membranaire Marquage par la lactoperoxydase des protéines exposées au MEC Mise en évidence par autoradiographie

Marquage des protéines à la surface membranaire • Marquage : marqueur radioactif ou fluorescent soluble (ne se fixe que sur la face exposée) • Utilisation d’enzymes protéolytiques • Anticorps marqués • SDS-PAGE

Exemple: SDS-PAGE des protéines de la membrane du globule rouge humain  environ 15 protéines majeures (15000 à 250000 D)

Marquage des protéines à la surface membranaire

Marquage des protéines à la surface membranaire

Isolement des membranes Centrifugations différentielles

Les radeaux lipidiques-RAFT Microdomaines maintenus par des chaînes longues et saturées de lipides (comme les sphingolipides) Considérés comme des changements de phase dans la bicouche lipidique qui se trouve enrichie en sphingolipides et cholestérol Chaînes longues  membrane plus épaisse

Les radeaux lipidiques-RAFT La bicouche lipidique est hétérogène: des domaines désordonnés et ordonnés sont séparés