Les puces à ADN

Définition Outil technologique miniaturisé. • Combinaison entre la microélectronique, la chimie, la biochimie, la biologie moléculaire, l'informatique et l'analyse d'image. • Permet d'analyser simultanément, un nombre considérable de séquences d'ADN contenues dans un échantillon biologique (sang, biopsie, eau, aliments etc.) • Synonymes : biopuce, micropuce, DNA chip, DNA microarray •

Format d’une micropuce

 Spot: ensemble de Sondes spéciques à une cible (un gène par exemple) Sonde: une séquence de nucléotides Surface de la puce 1 cm2

Principe de l'analyse:l'Hybridation

Etapes de réalisation d’une analyse ●

1/Fabrication de la puce – Lame de 1 cm2 de surface – Dépôt in situ de sondes sur la lame (400 000 !) ● sondes : cDNA, PCR, oligonucléotides 20-70mer ● L'emplacement des sondes et leur séquences sont connus avec précision

Etapes de réalisation d’une analyse ●

2/La réaction ●

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détection de fragments d'ADN/ARN contenu dans un échantillon (humain, bactérien...) Amplification de la cible recherchée par PCR Marquage (radioactivité, fluorescence...) Dépôt sur la puce Révélation par hybridation avec la sonde qui lui est complémentaire sur la puce

Etapes de réalisation d’une analyse 3/Obtention des résultats

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Mesure de la fluorescence Repérage des sondes ayant réagi avec l'ADN contenu dans l'échantillon testé Lecture de la puce par des méthodes optiques sophistiquées (balayage laser, caméras) couplées à un traitement informatique de l'image.

Résumé

Étape de réalisation d’une analyse

cDNA microArray mRNA étudié (malade) CY5

mRNA standard (sain) CY3

Spot G

Micropuce à CDNA

Mesure de l’expression différentielle = Ratio intensité cy5/intensité cy3

Exemple de Résultat d’analyse d’expression Deux ARN sont transcrits en cDNA  Marqués différemment (vert Cy3, rouge Cy5)  Interprétation Résultat: Jaune : expression égale Vert : down-régulé Rouge : up-régulé 

Oligonucléotides genechips (Affymetrix)

Oligonucléotides genechips (Affymetrix)

Les applications en développement Analyse microbiologique de l'eau ● Detection des OGM ● Génotpage des mycobactéries ● Analyse de l'expression des gènes ● Analyse de mutations génétiques ● Diagnostic biologique de maladies infectieuses et recherche de résistances ● Recherche pharmaceutique ● Séquençage ●

Analyse microbiologique de l'eau Contrôle de la qualité de l'eau de consommation ● Contrôle qualité en milieu industriel pour renforcer la sécurité des procédés et des produits ● Association Lyonnaise des Eaux Bio-Merieux ●

Detection des OGM Reconnaissance de l'origine des espèces animales qui composent les produits alimentaires ● Contrôle des semences par recherche de séquences provenant d'OGM ●

Génotpage des mycobactéries ●

Typage génétique (génotypage) de toutes les espèces de mycobactéries pathogènes (Tuberculose) ● ● ●

M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum M. xenopi, M. kansasii (souches atypiques) Par recherche de la spécificité d'espèce des mycobactéries : polymorphismes dans le gène de l'ARN 16S = signature

Recherche de profils de résistance à la Rifampicine

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Par recherche de mutations dans le gène rpoB qui confère à lui seul 90% des cas de résistance.

Projet Bio-Merieux

Analyse de l'expression des gènes En utilisant les puces à ARN (cible=ARN) ● Analyse du fonctionnement des gènes dans les tissus sains ou pathologiques ● Identifier les gènes particulièrement actifs dans certaines cellules ● Identification de nouveaux gènes associés aux maladies immunitaires inflammatoires rhumatismales (PR) et digestives (Crohn). ●

Analyse de mutations génétiques Identification des mutations génétiques et leur application en génétique médicale ● Utilisation des puces à ADN dans le diagnostic préinplantatoire ●

Diagnostic biologique de maladies infectieuses et recherche de résistances ●

Les puces sont porteuses de sondes spécifiques de certains germes pathogènes ●

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Les puces sont porteuses de sondes spécifiques de certaines régions de génomes viraux ●

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Détection rapide de mutations responsables de résistances à de nombreus antirétroviraux (HIV) Adaptation du traitement antiviral des patients par le clinicien

Les puces sont porteuses de sondes spécifiques capables de renseigner sur la présence de mutations responsables de résistance aux ATB dans certains génomes bactériens ●

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Détection de bactéries et virus responsables d'infection respiratoires (grippe H1N1) et génitales (HPV16, HPV18, HSV)

Prescription rapide d'un traitement adapté

société Bio-Mérieux

Recherche pharmaceutique (1) ●

Découverte de nouveaux médicaments ●

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Les puces à ARN permettent de savoir quels sont les gènes spécifiquement actifs dans les tissus malades. Ces gènes et les protéines correspondantes sont des cibles thérapeutiques

Mieux comprendre l'action des médicaments ●

Les puces à ADN permettent de savoir quels sont les gènes qui sont modulés dans une cellule sous l'effet d'un médicament. Ceci permet d'avoir une vision plus complète de son action.

Recherche pharmaceutique (2) La réponse individuelles aux médicaments diffère d'une personne à une autre et dépend de'un ensemble d'enzymes hépatiques (cytochromes P450). ● Des mutations de type SNP sont à l'origine des différences observées dans la réponse individuelle aux médicaments. ●Des puces ADN permettent de révéler ces polymorphismes ●Possibilité d'ajuster les doses de traitement en fonction du profil génétique de chaque patient. ●

Séquençage Les puces à ADN permettent de vérifier la séquence de certains gènes d'interêt (reséquençage) ● Appliqué sur des génomes de levures ou bactériens ●