Revue francophone d’information en sciences de la santé

Numéro Club de Recherche Clinique du Québec 54e réunion annuelle-2012

Vol.2 n°2

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Remerciements Nous remercions notre partenaire financier principal, le Fonds de recherche du Québec-Santé.

Nous remercions chaleureusement Dr Jean-Jacques Lebrun, professeur au département de médecine, division d’oncologie médicale, hôpital Royal Victoria, centre universitaire de santé McGill, Président du CRCQ 2012, pour avoir accepté notre invitation pour la rédaction de l’éditorial.

Image de couverture : Régulation des voies de signalisation des cytokines par les tyrosines phosphatases PTP1B et TCPTP. Signalisation en aval des récepteurs cytokines jusqu’a leurs cibles transcriptionnelles. Les deux modulateurs négatifs tyrosines phosphatases PTP1B et TC-PTP inhibent indépendamment ou simultanément les voies de signalisations des cytokines. Figure réalisée par Dr Noriko Uetani du laboratoire du Dr Michel Tremblay.

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Table des matières Éditorial 3

Retour sur la 54e réunion annuelle du Club de Recherches Cliniques du Québec Jean-Jacques Lebrun

ÉDITEUR Société de la revue Médecine Sciences 5022, chemin de la Côte-des-Neiges Montréal, Québec, H3V1G6 Canada DIRECTRICE GÉNÉRALE Anne-Laure Nouvion RÉDACTRICE EN CHEF Danielle Jacques ADJOINTE À LA DIRECTION Clémence Cireau

Revues 7

Jonathan B. Béland, James E. Duverger, Philippe Comtois

24

TC-PTP, un modulateur clé du système immunitaire Stéphanie Bussières-Marmen, Michel L.Tremblay

38

Les dynamiques calciques : côté lumineux de la signalisation endothéliale Chimène Charbel, Fanny Toussaint et Jonathan Ledoux

53

ADJOINTE À L’ÉDITION Anik Tia-Samson ISSN :1927-5897

Génie tissulaire appliqué à l’activité électrique cardiaque autonome : une alternative au pacemaker électronique

Les granules de stress à ARN : une question de vie ou de mort Laetitia Coudert, Rachid Mazroui

72

[email protected]

Les interactions de la corticostimuline (ACTH) avec son récepteur MC2 : nouvelles connaissances et perspectives Nicole Gallo-Payet

93

Immunothérapie pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique Audrey Labarre, Bastien Paré, Lydia Touzel-Deschènes, François Gros-Louis

108

Les interactions BHE/leucocytes en sclérose en plaques Catherine Larochelle, Alexandre Prat

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ÉDITORIAL

Retour sur la 54e réunion annuelle du Club de Recherches Cliniques du Québec

Professeur Jean-Jacques Lebrun Président du CRCQ 2012

Chères et chers collègues,

C

haque année, le Club de Recherches Cliniques du Québec (CRCQ) organise un colloque de trois jours, dont la mission est de permettre à ses membres ainsi qu’à leurs étudiants gradués et stagiaires postdoctoraux de présenter leurs travaux scientifiques dans le domaine

de la recherche médicale. Ce congrès réunit un grand nombre de scientifiques, venant principalement

des différentes universités francophones du Québec et de la France. Le CRCQ se distingue également particulièrement par l›encadrement privilégié offert aux étudiants gradués et stagiaires postdoctoraux, pour qui les frais d’inscription sont gratuits. Cette année, le congrès annuel s’est déroulé au complexe hôtelier « Estrimont Suites et Spa » dans la magnifique région du mont Orford, les 11-13 octobre derniers. Comme par le passé, cette année Vol.2 n°2

Éditorial 4

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encore, nous avons eu un excellent programme scientifique, très dense et d’une très grande variété. Nous avons eu 12 séances comprenant des présentations orales faites par des professeurs, étudiants gradués, et stagiaires postdoctoraux (8 présentations orales par séance) ainsi que plusieurs sessions de présentations par affiche, qui toutes ont permis de refléter, à sa juste valeur, l’excellence de la qualité scientifique au sein de la communauté francophone au Québec. Parmi les moments forts, on retiendra l’ouverture du congrès avec la présentation de la conférencière invitée par le président, la Dre Nicole Gallo-Payet et son brillant exposé sur son programme et ses travaux de recherche en endocrinologie de la glande surrénale. Les prix habituels du CRCQ ont bien évidemment été attribués lors de notre réunion annuelle. Ces prix prestigieux incluent le très attendu prix Michel Sarrazin qui est octroyé afin de souligner la carrière scientifique et la contribution exceptionnelle d›un professeur québécois chevronné. Cette année, le prix «Michel Sarrazin» a été remis au Dr Michel Tremblay de l’Université McGill. Lors de la remise du prix, le Dr Tremblay nous a présenté ses travaux sur le rôle des protéines tyrosines phosphatases dans les maladies humaines et leurs enjeux biologiques et pharmacologiques. Autre prix prestigieux du CRCQ, le prix du mentor scientifique a été remis cette année au Dre Gallo-Payet de l’Université Sherbrooke. Plusieurs anciens étudiants de la Dre Gallo-Payet sont venus rendre hommage à leur directrice de thèse et ont ainsi pu témoigner de ses excellentes qualités de mentorat. Nous avons également assisté à la remise du prix André-Dupont, attribué à un jeune professeur, établi depuis moins de 10 années et dont la carrière a été stellaire. Cette année, le Prix André Dupont a été remis au Dr Alexandre Pratt du Centre de recherche du CHUM de l’Université de Montréal. Nouveauté cette année, la mise en place d’une session « rencontre avec les professeurs ». Les étudiants ont ainsi eu l’opportunité de rencontrer le récipiendaire du prix André-Dupont lors d’une session de discussion au cours de laquelle ils ont pu discuter de son parcours universitaire, de son cheminement de carrière, de ses projets de recherche ainsi que de son expérience en tant que jeune professeur ayant démarré son propre laboratoire dans une université canadienne. Vol.2 n°2

Éditorial 5

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Pour la traditionnelle matinée des chercheurs boursiers, 6 jeunes professeurs venant des différentes universités du Québec et ayant moins de 10 ans de carrière ont été sélectionnés par le comité exécutif du CRCQ pour venir présenter leurs travaux de recherche. Cette matinée a été un franc succès avec un programme scientifique tout aussi varié qu’excellent. Les 6 professeurs sélectionnés par le comité exécutif sont les Drs Marie-France Hivert, Rachid Mazroui, Jonathan Ledoux, Marie-Josée Boucher, Philippe Comtois et François Gros-Louis. Comme vous le savez, le CRCQ se distingue plus particulièrement par l›encadrement privilégié offert aux étudiants gradués qui en sont, dans plusieurs cas, à leurs premières armes dans la participation à des congrès scientifiques. Cette expérience développe leur sens critique et les prépare pour des congrès internationaux où ils contribueront à un meilleur rayonnement de la recherche biomédicale effectuée au Québec. Des prix sont par ailleurs réservés et remis à des étudiants; le Prix Hans Selye qui récompense les meilleures présentations par affiche, remis cette année à M. Bruno Johnson (étudiant au Ph.D.) et M. Adrien Moreau (étudiant au Ph.D.) ainsi que le prix Jacques Genest, attribué pour la meilleure présentation orale, remis cette année à Mme Sophie Mathieu (étudiante au Ph.D.). Enfin, autre nouveauté cette année, le comité exécutif du CRCQ a instauré un partenariat avec la revue scientifique francophone Médecine Sciences Amérique (MSA). Cette collaboration implique, entre autres, l’édition d’un numéro spécial MSA/CRCQ post-congrès dans lequel nous publierons chaque année, une série d’articles révisés par les pairs et sélectionnés à partir des présentations de nos lauréats, conférenciers invités ainsi que parmi les sessions orales et par affiche. Vous pourrez notamment retrouver dans ce numéro spécial MSA/CRCQ des articles de revues rédigés par les jeunes professeurs universitaires boursiers mentionnés précédemment. Au nom de tout l’exécutif du CRCQ, il nous a fait plaisir de vous accueillir à Estrimont Suites et Spa et nous vous souhaitons une bonne lecture de ce numéro spécial MSA/CRCQ. Cordialement, Professeur Jean-Jacques Lebrun Vol.2 n°2

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REVUE

Génie tissulaire appliqué à l’activité électrique cardiaque autonome : une alternative au pacemaker électronique ? Tissue engineering applied to cardiac autonomous activity: an alternative to electronic pacemaker? Jonathan B. Béland, James E. Duverger, Philippe Comtois Centre de Recherche, Institut de Cardiologie, Montréal, Canada Département de Physiologie / Institut de Génie biomédical, Université de Montréal Correspondance Philippe Comtois, PhD Centre de Recherche, Institut de Cardiologie 5000 Bélanger Montréal, Québec, H1T 1C8 Canada 514 376-3330 poste 2615 [email protected]

Date de réception : 31 octobre 2012 Date d’acceptation : 17 avril 2013

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Résumé La bradycardie, un rythme anormalement lent du cœur, constitue un trouble du rythme assez courant ayant pour traitement l’implantation de pacemakers électroniques. Sachant que leur utilisation comporte des limitations importantes, le développement d’un feuillet de cellules pacemakers biologiques est une option à envisager parmi les approches possibles. Ainsi, les propriétés d’automaticité de cardiomyocytes et ultimement de cellules pluripotentes peuvent être optimisées in vitro avant d’être attachées au myocarde. Nous présentons, ici, les principes de générations d’automaticité électrique cardiaque et l’influence qu’a l’environnement de culture sur ce mécanisme autonome.

Summary Bradycardia is a common heart disease characterized by a slow activation rate that can be treated by the implantation of electronic pacemaker devices pacing the myocardium. Because these devices have several important limitations, the development of biological pacemaker patches based on tissue engineering could be very interesting among the possible approaches. Cardiomyocytes, and ultimately pluripotent cells, autonomous activity can be optimized in vitro to reach targeted rhythms through ion channel remodelling. The engineered tissue could then be grafted to the myocardium where functional electrical coupling would lead to entrainment. This review paper presents the basic principles of cardiac automaticity and the influence of in vitro environment on this autonomous mechanism.

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Mécanismes responsables de l’automaticité électrique cardiaque et troubles de rythme

P

our réaliser ces fonctions biologiques,

de l’échangeur sodium-calcium (INCX), le courant

le cœur compte sur le bon fonction-

calcique transitoire (ICaT) et le courant calcique

nement de son système électrique.

de type L (ICaL) provoquant un flux net de cations

L’activité électrique est initiée du nœud sinusal,

entrant dans la cellule durant la diastole qui dé-

le pacemaker naturel du cœur, et se propage

polarisent la membrane jusqu’au seuil d’activa-

de façon ordonnée via le système de conduc-

tion. Une dépolarisation diastolique est favori-

tion. La formation du potentiel d’action (PA) à

sée dans les cardiomyocytes (CM) autonomes

l’origine de l’activité électrique autonome est

par la réduction de IK1 et Ito, la désactivation de IKr,

possible grâce à différents courants ioniques

l’augmentation de ICaL [1] et l’activation de If [2].

(I) dont la dynamique et la perméabilité spé-

Le courant If, contrôlé par l’AMPc, activé par la

cifique en font des joueurs importants à diffé-

stimulation des récepteurs β-adrénergique et

rentes phases (figure 1A). Au niveau cellulaire,

inhibé par la stimulation des récepteurs musca-

l’automaticité repose sur trois mécanismes inti-

riniques de type M2, représente un mécanisme

mement couplés aux horloges : membranaire,

important du système nerveux autonome dans

calcique et mécanique (figure1B). Une horloge

la régulation du rythme cardiaque [3]. If circule à

est un mécanisme autonome capable de géné-

travers les Hyperpolarization Cyclic Nucleotide-

rer des PA et de maintenir le rythme d’activation

gated channel (HCN), des canaux qui s’activent

en absence de toute stimulation électrique ou

lors de l’hyperpolarisation. Chez les mammi-

humorale.

fères, quatre sous-unités homologues existent

L’horloge membranaire résulte de la

(HCN1-4) formant des tétramères distincts

synergie de plusieurs courants membranaires,

ayant des propriétés biophysiques différentes.

notamment: le courant pacemaker If, les cou-

Le canal formé par HCN4 est prédominant dans

rants potassiques sortants (IK1 et Ito), le courant

le nœud sinusal ; selon des résultats obtenus

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Figure 1 (A) Exemple d’un potentiel d’action enregistré par microélectrode et rôle des courants ioniques ( ↑ : sortant ↓ : entrant) À un potentiel autour de -70 mV, une certaine perméabilité aux courants ICaT (courant calcique entrant transitoire) et INCX (courant de l’échangeur Na+/Ca2+) est présente. La dépolarisation est induite par le courant sodique entrant (INa) qui est suivi d’une repolarisation rapide produite par l’inactivation de INa et l’activation du courant potassique transitoire sortant indépendant du Ca2+ (Ito). Il s’ensuit une phase d’équilibre entre ICaL (courant Ca2+ lent) entrant et le courant potassique IKur (courant potassique ultra rapide) sortant. La repolarisation est ensuite produite par des courants potassiques (IK) (IKr : composante rapide du courant potassique sortant tardif de rectification IK. IKs : composante lente du courant potassique sortant tardif de rectification IK.). Le maintien du potentiel de repos ainsi que de la phase de dépolarisation lente est dû à IK1 (courant potassique à rectification entrante) et If (courant pacemaker). (B) Schéma simplifié d’un cardiomyocyte Horloge membranaire : synergie de courants membranaires permettant la dépolarisation durant la diastole. Horloge calcique : oscillation de la [Ca2+] intracellulaire. Le sous-espace est l’espace sous-membranaire où la concentration locale de calcium est plus élevée; aussi connu sous le terme « espace dyadique ». Horloge mécanique : mécanisme permettant l›adaptation rapide du rythme suite à la déformation mécanique. ICSE : courant généré par les canaux sensibles à l’étirement. RyR : récepteur des canaux à ryanodine. SERCA : pompe Ca2+-ATPase du réticulum sarcoplasmique. Vol.2 n°2

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dans un modèle de souris déficiente en HCN4,

lulaires. L’oscillation du Ca2+ est indépendante

il n’est pas essentiel à l’obtention de l’automati-

de ICaL et INCX et du potentiel transmembranaire ;

cité ; il sert plutôt à sa stabilisation [4]. Le canal

elle persiste quand ces courants sont bloqués

formé par HCN2 est moins fortement exprimé

et que le potentiel est fixé par voltage imposé

dans le nœud sinusal que celui de HCN4, il sert

[7]. Les contractions cessent dans les CM de

en complément et prend la relève dans le cas

souris néonatales quand les RyR et IP3R sont

d’une déficience du canal formé par HCN4 [4].

inhibés simultanément [7]. Les oscillations du

Du point de vue fonctionnel, If permet la dépo-

Ca2+ peuvent interagir avec l’échangeur Na+/

larisation lente lors de la diastole qui active IcaT

Ca2+ (NCX); le courant entrant dépolarise la cel-

et qui prend le relais d’If tout en activant INCX.

lule jusqu’au seuil d’activation et initie le PA [7].

Quand le potentiel d’activation de ICaL est atteint,

Les horloges membranaires et calciques n’ex-

le PA est initié. Le rôle joué par If a été démontré

pliquent pas la rapidité de l’adaptation du rythme

expérimentalement par l’arrêt [5] ou le ralen-

cardiaque aux changements de contraintes mé-

tissement de l’activité autonome dans les CM

caniques telles que la charge hémodynamique.

quand il est inhibé par mutation des canaux

Le cœur même ex vivo adapte son rythme car-

HCN ou par blocage pharmacologique par l’iva-

diaque autonome très rapidement. Cette ré-

bradine) [6].

ponse chronotrope positive est indépendante du

De son côté, l’horloge calcique résulte

système adrénergique et cholinergique [8]. Elle

des oscillations de la concentration interne de

est aussi indépendante de l’activation neurale

Ca2+ ([Ca2+]i) de la cellule. Le réticulum sarco-

intra ou extracardiaque que ce soit pour le cœur

plasmique relâche spontanément de petites

entier ou à différents niveaux isolés tels le tissu

quantités de Ca2+ qui se lient localement aux

auriculaire [9], le nœud sinusal [10] et même la

récepteurs à ryanodine (RyR) et à l’inositol-tri-

cellule du nœud sinusal [11]. Ce phénomène,

phosphate (IP3R), amplifiant le phénomène de

appelé horloge mécanique, repose sur la ré-

relâche jusqu’à l’initiation de contractions cel-

troaction mécano-électrique qui décrit la régu-

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lation interne liant l’environnement mécanique

figure 2B, où leur étirement uniaxial aigu induit

du CM avec son activité électrique [12]. Cette

l’accélération de leur fréquence autonome.

régulation par les contraintes mécaniques est

La flexibilité et la robustesse de l’auto-

aussi existante dans des monocouches de CM

maticité sont rendues possibles grâce au cou-

de rats néonataux (figure 2A) avec activité auto-

plage intime des trois horloges. La communau-

nome. Un exemple de réponse est présenté à la

té scientifique a longtemps été divisée sur la

Figure 2 (A) Projection maximale de cardiomyocytes de rats néonataux in vitro marqués pour le noyau (DAPI : en bleu) et pour l’actine (Phalloïdin Alexa-555 en rouge) réalisée par microscopie confocale. (B) Exemple de la présence de l’horloge mécanique dans des feuillets de cardiomyocytes néonataux en culture. La fréquence (évaluée par vidéomicroscopie) avant étirement (ligne bleue) est rapidement augmentée suite à un étirement de 30% (ligne rouge) avant de redescendre.

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source primaire de l’automaticité oscillant entre

turbation transitoire ou persistante du rythme

l’horloge membranaire et l’horloge calcique [13].

cardiaque normal. Ainsi, une augmentation de

Récemment, il semble que l’idée du couplage

ICaL et INCX durant la période diastolique provoque

important entre les deux horloges mène au

une surcharge de calcium libre intracellulaire qui

consensus [14]. Ainsi, l’oscillation de la [Ca2+]i a

est une source majeure des post-dépolarisation

besoin de NCX pour générer le PA. D’un autre

retardées. Des dépolarisations précoces de la

côté, l’entrée de Ca2+ via ICaL et ICaT rehausse la

phase 2 et de la phase 3 peuvent également

[Ca2+]i, qui active les RyR et IP3R. Cependant, le

survenir par une augmentation de ICaL et une di-

concept d’horloge mécanique est relativement

minution de IK1 respectivement. Le syndrome de

récent et l’importance de son rôle reste à confir-

dysfonction sinusale est un trouble de rythme af-

mer. Cette horloge serait aussi couplée aux

fectant autant les hommes que les femmes [24].

deux autres horloges. Ainsi, la sensibilité à la

Un patient sur 600 (de plus de 65 ans avec pa-

stimulation mécanique a été reportée dans les

thologie cardiaque) en est affecté. Il est souvent

canaux ioniques d’If [15, 16], INa [17], ICaL [18], INCX

lié à un processus dégénératif, une fibrose du

[19], IK [20], tous reliés à l’horloge membranaire.

nœud sinusal, affectant également des sections

D’autre part, l’horloge mécanique est couplée à

adjacentes du système de conduction comme le

l’horloge calcique en favorisant l’augmentation

nœud auriculo-ventriculaire et les faisceaux de

de la [Ca2+]i par une éventuelle élévation de la

Hiss causant des troubles dans l’automaticité et

probabilité d’ouverture des RyR [21], une aug-

dans la propagation électrique [25]. Chez l’en-

mentation de la fuite de Ca2+ du réticulum sar-

fant, ce rare syndrome est associé à des malfor-

coplasmique [22] et une diminution du taux de

mations cardiaques congénitales pouvant cau-

recapture [23] (figure 1B).

ser des anomalies du système de conduction,

Le déséquilibre des horloges mène à des

à une hypertonie vagale ou à des complications

conséquences importantes, notamment des

post-chirurgies [24, 26]. Le syndrome de dys-

troubles de rythme se manifestant par une per-

fonction sinusale peut également être causé par

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des mutations des canaux ioniques et des jonc-

une augmentation de la durée du PA et de dimi-

tions communicantes qui ont pour effet d’induire

nuer la vitesse de conduction [24].

L’implantation de pacemakers, les complications associées et les alternatives possibles L’implantation de pacemaker (PM) est de plus

que chez l’adolescent, les électrodes sont plus

en plus utilisée pour contrer les troubles de

souvent implantées dans l’endocarde car elles

rythme et diminuer la mortalité et la morbidité

demandent une chirurgie moins complexe [28].

associées [27]. La technologie a beaucoup

Chez l’enfant, le PM monochambre est privilé-

évolué depuis l’implantation du premier PM

gié; il est plus petit et a une durée de vie su-

en 1958 passant d’un module très simpliste à

périeure [28]. L’utilisation de PM est associée

des systèmes comportant des électrodes mul-

à un fardeau important pour le système de la

tichambres pouvant induire des fréquences

santé lorsque les PM deviennent défectueux et

de stimulation variables s’adaptant, grâce à

doivent être remplacés. Les limitations liées aux

des algorithmes performants, aux besoins du

PM électroniques pourraient être surpassées

patient [26]. Plusieurs limitations sont encore

chez certains patients si un regain de la fonction

associées à leur utilisation. Par exemple, la

automatique, via génie tissulaire, était possible.

durée de vie des batteries varie entre 3 et 15

Par contre, les difficultés associées à la dispo-

ans et dépend du nombre d’actions, de la fré-

nibilité de CM humains et à la perte significative

quence et de l’intensité qui sera requise pour

de CM après une transplantation font en sorte

stimuler adéquatement le cœur. Chez l’enfant,

de limiter cette réalisation [29].

les électrodes sont généralement positionnées

Toutefois, l’utilisation de la culture cellulaire est

dans l’épicarde afin d’éviter d’obstruer la circu-

une option avantageuse pour réparer ou rem-

lation vasculaire et pour éviter d’affecter l’inté-

placer le tissu dysfonctionnel. L’ensemence-

grité de la valve auriculo-ventriculaire alors

ment de cellules souches embryonnaires hu-

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maines dérivées en CM sur un support poreux

tion fonctionnelle en ce qui a trait à la perfusion

biodégradable permet de créer une construc-

du cœur constituant un résultat prometteur afin

tion tissulaire qui a pu être greffée in vivo sur

d’enrayer la limite d’épaisseur de la construc-

un cœur de rat. L’épaisseur de la construction

tion. Toutefois, les propriétés électriques (cou-

reste une limitation due au principe de diffusion

plage avec les autres CM ou activité autonome)

limitant la survie des cellules à une distance de

de même que les propriétés mécaniques (force

quelques centaines de micromètres du capil-

de contraction) du greffon restent encore à être

laire le plus près [30]. Récemment, l’utilisation

étudiées. Le type cellulaire utilisé ne permet

de tri-culture (cellules souches embryonnaires

pas non plus l’utilisation actuelle en clinique.

dérivées en CM + cellules endothéliales + fibro-

L’utilisation de cellules pluripotentes provenant

blastes embryonnaires) a permis de former un

de l’hôte dont on induirait la différenciation en

tissu vascularisé. L’accumulation de billes fluo-

lignée cardiaque autonome permettrait d’éviter

rescentes dans le myocarde de l’hôte et dans

les troubles de rejet et constituerait une avenue

le greffon, suite à l’injection de billes fluores-

intéressante pour former un feuillet de cellules

centes dans le ventricule, montre une intégra-

optimisées appelé biopacemaker (BPM) [29].

Transformation des cellules pluripotentes en cellules PM Différentes techniques peuvent être utilisées

et fonctionnelles semblables au tissu d’origine.

pour induire un remodelage protéique qui affec-

Le cœur, in vivo, est assujetti à deux types de

tera la physiologie de cellules pluripotentes,

stimulation principalement : électrique et méca-

soit : contrôler l’environnement de culture, uti-

nique. Ainsi, les conditions de culture doivent

liser la biologie moléculaire ou utiliser la thé-

être similaires à l’environnement in vivo puisque

rapie génique. Le contrôle de l’environnement

les cellules pluripotentes induites en CM seront

est important afin d’amener les cellules à avoir,

affectées par la présence ou l’absence de ces

idéalement, des caractéristiques structurelles

stimuli.

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NUMÉRO CRCQ Effets de la stimulation électrique Il existe deux méthodes de stimulation élec-

ils adoptent une forme arrondie et un remode-

trique : locale et globale. La stimulation locale

lage de l’actine et de la troponine-I provoque

se fait par injection de courant en un point précis

une perte progressive des propriétés contrac-

du milieu extra- ou intracellulaire à l’aide d’une

tiles [33]. D’un point de vue fonctionnel, les CM

électrode générant l’activation de cellule locale

soumis à la stimulation électrique ont une plus

et la propagation à toutes les cellules intercon-

grande amplitude de contraction synchronisée,

nectées. D’un autre côté, la stimulation globale

une plus grande fréquence maximale d’entraî-

dépolarise l’ensemble des cellules par l’applica-

nement [32] et sont moins hypertrophiés [34].

tion d’un champ électrique issu de la différence

La stimulation électrique permet la génération

de potentiel entre deux électrodes parallèles;

de contractions régulières qui optimise la ges-

cette forme de stimulation est à favoriser dans

tion interne du Ca2+ [35], la densité et la fonction

notre cas, car elle facilite l’enlignement ordonné

des canaux calciques de type L (CCL); élément

des cellules qui, par séparation de charges du

clé de l’horloge membranaire. Parallèlement, un

cytosol, se comportent comme des dipôles s’ali-

rythme irrégulier ou trop rapide provoque une

gnant dans la direction du champ [31].

régulation à la baisse de ICaL [36] et de la pompe

Lorsque des CM de rats néonataux sont cultivés

SERCA [37] et pourrait donc influencer la fré-

in vitro, la stimulation électrique affecte la géo-

quence d’activation. Ainsi, la fréquence d’acti-

métrie, l’alignement des sarcomères et la distri-

vation du BPM pourrait dépendre de l’expres-

bution spatiale des connexines (Cx)-43 et des

sion de canaux ioniques qui peut être modifiée

mitochondries [32]. Sans stimulation électrique,

par stimulation électrique [36].

Effets de la stimulation mécanique Dans un CM, l’activité électrique est directe-

tion. Toutefois, la littérature révèle de plus

ment reliée à l’activité mécanique par un prin-

en plus la présence d’une rétroaction méca-

cipe appelé le couplage excitation-contrac-

no-électrique [38] due aux canaux sensibles

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à l’étirement (CSE). Conséquemment à leur

de HCN2 [15] et pourrait ainsi produire un PA

fonction, les CM sont soumis à des chan-

qui provient purement d’une activation méca-

gements dynamiques extrêmes en termes

nique. Il a également été montré que des CM

de stress et d’étirement [39] et constituent

soumis à un étirement du support flexible de

donc des cibles intéressantes afin d’étudier

culture (in vitro) ou à une surcharge de vo-

l’impact de la rétroaction mécano-électrique

lume (in vivo) vont modifier l’expression de

puisque l’impossibilité de s’adapter mènera

certaines protéines, facteurs de croissance

au développement de pathologies comme

et cytokines, favorisant le développement de

l’hypertrophie cardiaque [40].

l’hypertrophie cardiaque [44]. L’hypertrophie

Une activation des CSE permet de tra-

cellulaire peut faire varier la fréquence auto-

duire une activité mécanique en signal élec-

nome par le prolongement du PA [45], l’aug-

trique. De manière générale, l’étirement pro-

mentation de la capacité membranaire et la

voque l’ouverture des canaux dépolarisant la

diminution de ICaL [46]. Ainsi, lorsque les CM

cellule au repos par l’entrée de Na+ et de Ca2+.

sont cultivés in vitro, il s’avère important de

L’entrée de Ca2+ accentue l’entrée de Na+ via

procéder à un renouvellement adéquat du mi-

NCX qui dépolarise le potentiel membranaire

lieu de culture afin de diminuer l’impact de la

parfois jusqu’au seuil initiant le PA [41]. L’éti-

sécrétion d’agents sur le développement de

rement peut induire des extrasystoles et de

l’hypertrophie cellulaire.

l’activité spontanée dans les CM ventricu-

Le rôle des Cx est de connecter le milieu

laires [42]. Il produit une augmentation de IK1

intracellulaire de CM pour permettre à l’acti-

via une surexpression des canaux K+ à rec-

vité électrique de se propager rapidement et

tification entrante et ce remodelage est res-

de manière ordonnée. Ainsi, une diminution

ponsable du raccourcissement de la durée du

des niveaux de Cx augmente la résistance in-

PA dans des CM auriculaires [43]. De plus,

tercellulaire pouvant contribuer à perturber la

l’étirement augmente If via une surexpression

conduction électrique [44]. L’étirement semble

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moduler la propagation électrique en surexpri-

de la stimulation électrique et mécanique sur le

mant Cx-43 produisant une augmentation de la

remodelage des canaux ioniques et la conduc-

vitesse de conduction [44]. Les effets connus

tion intercellulaire sont résumés au tableau I.

Vers l’optimisation de l’activité électrique autonome des biopacemakers Il est facile de constater qu’il reste encore

génique. Par exemple, T-Box factor 3 (TBX3),

plusieurs étapes avant d’arriver à produire un

un facteur de transcription nécessaire au dé-

BPM optimisé pour une utilisation en clinique.

veloppement de plusieurs tissus, pourrait être

Un aperçu de l’approche de génie tissulaire pri-

ré-exprimé pour reprogrammer les cellules du

vilégiée pour produire un BPM optimisé est pré-

BPM en cellules pacemakers. Des études in

senté à la figure 3. Des cellules pluripotentes,

vitro ont révélé que TBX3 réduit la conduction

par exemple, des fibroblastes de la peau sont

intercellulaire, INa et IK1 [47] favorisant l’auto-

isolés de sujets atteints de troubles de rythme

maticité. Le BPM est ensuite détaché de son

et reprogrammés via des facteurs de transcrip-

support de fabrication et étendu sur la partie

tion dans un état de cellules souches embryon-

d’intérêt du myocarde pour une période de 10

naires [29]; les cellules sont ensuite ensemen-

à 15 minutes afin de permettre l’adhésion de

cées et différentiées en cellules cardiaques

ce dernier et ce, sans suture [48]. Le greffon

dans un environnement in vitro contrôlé par

pourrait ainsi améliorer les fonctions automa-

des processus de stimulation automatisés.

tiques. Dans ce contexte, grâce au génie tis-

Les cellules n’ayant pas d’automaticité d’un

sulaire, les limitations des PM électroniques

point de vue électrique devront être transfor-

pourraient être surpassées par l’utilisation

mées avant ou après la greffe par thérapie

des PM biologiques.

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Courant

If

ICa

Effet de la stimulation électrique

Effet de la stimulation mécanique

Baisse de l’expression de HCN2 et HCN4 de plus de 50 % suite à une stimulation électrique rapide pour reproduire l’effet d’une tachyarythmie [16]

Diminution de If de 40 % chez des lapins avec insuffisance cardiaque causée par la présence d’une surcharge de volume et de pression [49]

ICaL est augmenté de 14 % par la stimulation électrique rapide dans les cardiomyocytes auriculaires de rats [50]

ICaL est augmenté de 19 % dans les cardiomyocytes de l’épicarde de rats dans un modèle de surcharge de pression [18] L’expression des canaux neuronaux Nav1.1 et Nav1.3 exprimés dans les cardiomyocytes est doublée dans le nœud sinusal durant l’insuffisance cardiaque associée avec une surcharge volumique et de pression [17]

INa

INCX

La densité de INCX est augmentée dans cardiomyocytes de patients avec fibrillation auriculaire (possiblement causée par l’activation électrique rapide) [19]

IK

Régulation à la hausse de IKr par stimulation rapide dans les cellules auriculaires HL-1 [36]

Accélère l’activation dépendante du voltage et ralenti l’inactivation via la sous-unité Kv des canaux K+ [20] La densité de IK1 et IKur est significativement augmentée dans les cardiomyocytes auriculaires de rats néonataux et la densité de Ito est significativement diminuée [43]

Augmente la conduction électrique intercellulaire en concentrant les connexines-43 aux extrémités des cellules [32]

Augmente la conduction électrique intercellulaire par la surexpression de connexines-43 [44]

Conduction intercellulaire

Tableau 1 Remodelage des courants ioniques et de la conduction intercellulaire par la stimulation électrique / mécanique

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Figure 3 Approche de génie tissulaire privilégiée pour création de tissu de remplacement Des cellules pluripotentes sont prélevées de sujets atteints de troubles du rythme. Ces cellules pluripotentes sont ensuite soumises à différents agents et à différentes stimulations contrôlées afin de produire par génie tissulaire un tissu de remplacement optimisé qui peut être greffé au myocarde de ce même patient atteint de troubles de rythme. BioMol : biologie moléculaire, SM : stimulation mécanique, SE : stimulation électrique, Tx gènes : thérapie génique.

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Glossaire [Ca2+]i : concentration intracellulaire de calcium

NCX : échangeur Na+/ Ca2+ NS :

nœud sinusal

BPM : biopacemaker

PA :

potentiel d’action

CCL :

PM :

pacemaker

RS :

réticulum sarcoplasmique

canaux calciques de type L

HCN : Hyperpolarization Cyclic

I:

Nucleotide-gated channel

RyR : récepteurs à ryanodine

courant

TBX3 : T-Box factor 3

IP3R : récepteurs à l’inositol-Triphosphate

Remerciements et financements Les auteurs remercient les réviseurs pour la révi-

Québec en santé, de la fondation de l’Institut de Car-

sion du manuscrit. Cet article de revue a été réalisé

diologie de Montréal et du Conseil de recherches en

grâce aux subventions du Fond de recherche du

sciences naturelles et en génie du Canada.

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REVUE

TC-PTP, un modulateur clé du système immunitaire T-cell Protein Tyrosine phosphatase (TC-PTP), a key player in immunity Stéphanie Bussières-Marmen, Michel L. Tremblay Centre de Recherche sur le Cancer Rosalind et Morris Goodman Département de Biochimie, Université McGill, Montréal

Correspondance Michel L.Tremblay, PhD Centre de Recherche sur le Cancer Rosalind et Morris Goodman Université McGill, local 601 Montréal, Québec, H3A 1A3 Canada 514 398-8280 [email protected]

Date de réception : Date d’acceptation :

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22 novembre 2012 11 février 2013

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Résumé TC-PTP (PTPN2) est une protéine tyrosine phosphatase fortement exprimée dans le système hématopoïétique et qui assure une diversité de rôles dans le développement et la réponse immunitaires. Nommée en référence aux cellules T, dans lesquelles elle a été découverte, elle est présente de façon ubiquitaire chez les mammifères. De récentes études génomiques ont établi un lien entre cette phosphatase et certaines maladies auto-immunes. D’ailleurs les souris génétiquement déficientes en TCPTP ont permis d’identifier son rôle de régulateur négatif des sentiers de signalisation, tel Jak1/3-STAT, dans un grand nombre de cellules hématopoïétiques. Ces découvertes positionnent donc TC-PTP comme une enzyme clé dans la modulation du système immunitaire ainsi qu’un gène important dans plusieurs maladies auto-immunes humaines.

Summary T-Cell Protein Tyrosine phosphatase (TC-PTP, gene name PTPN2) is a protein tyrosine phosphatase highly expressed in hematopoietic tissues. Genome wide association studies have linked this phosphatase to several autoimmune diseases in humans. In accordance, TC-PTP knock-out (KO) mice succumb to severe anemia, systemic inflammation and splenomegaly within 3-5 weeks of birth. The characterization of the KO mouse model helped clarify TC-PTP’s role in different immune cell lineages. In vivo studies also demonstrated the negative regulatory role of TC-PTP in different signalling pathways important in immune development such as Jak1-3-STAT. Hence the phosphatase is a key player in the modulation of the immune system and its study will provide some understanding of how the gene PTPN2 is linked to autoimmune disease in humans.

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STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 25

NUMÉRO CRCQ Introduction

P

our assurer leur développement et

Cette phosphatase, aussi connue sous

leur activation, les cellules du système

le nom de PTPN2 (nom du gène), a été clo-

immunitaire dépendent de façon es-

née à partir d’ARN messagers de cellules T

sentielle d’un réseau de signalisation induit par

humaines, ce qui est à l’origine de son nom [3].

différentes cytokines. La phosphorylation tem-

Sa fonction n’est cependant pas restreinte aux

poraire des acides aminés (aa) tyrosines chez

lymphocytes T et elle est présente de façon ubi-

plusieurs protéines de cette signalisation est

quitaire, quoique fortement exprimée dans les

une modification post-translationnelle néces-

cellules du système hématopoïétique. Trois iso-

saire à la propagation des signaux de l’extérieur

formes de TC-PTP sont exprimées chez la sou-

de la cellule jusqu’au noyau cellulaire. Cette

ris mPtpn2-001 (382aa), mPtpn2-002 (406aa)

modification post-translationnelle peut mener à

et mPtpn2-003 (363aa), codant respective-

l’activation ou à l’inhibition du signal. Au cours

ment pour des protéines de poids moléculaires

des dernières années, de nombreuses études

de 45kDa, 48kDa et 42.3kDa. Chez l’humain,

ont démontré l’importance des récepteurs tyro-

plus de 15 épissages différents ont été identi-

sines kinases en tant qu’immunorégulateurs [1].

fiés et pas moins de cinq isoformes protéiques

Les protéines tyrosines phosphatases (PTP)

sont prédites. Cependant comme chez la sou-

qui déphosphorylent ces résidus assurent des

ris, seules trois formes humaines majeures de

rôles tout aussi significatifs et leur absence peut

PTPN2 sont présentes : hPtpn2-001 (353aa),

mener à divers dysfonctionnements tels que

hPtpn2-002 (415aa) et hPtpn2-003 (387aa). Il

le développement de cancers [2]. C’est entre

faut souligner que les deux formes Ptpn2-001

autres le cas de la protéine tyrosine phospha-

et Ptpn2-002 diffèrent en raison de l’épissage

tase des cellules T (TC-PTP), qui remplit diffé-

alternatif du dernier exon lors de la transcrip-

rentes fonctions chez de nombreuses cellules

tion du gène. L’isoforme de 45kDa (Ptpn2-001)

du système immunitaire dont, comme son nom

est localisée dans le noyau alors que celle de

l’indique, les lymphocytes T (Figure 1).

48kDa (Ptpn2-002) se retrouve au niveau du

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STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 26

NUMÉRO CRCQ

Figure 1 Schéma des rôles de TC-PTP dans les différentes lignées hématopoïétiques TC-PTP affecte différentes lignées hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse, du thymus et des tissus périphériques. Les lignées positivement régulées par la phosphatase sont encadrées en vert et celles négativement régulées le sont en rouge.

réticulum endoplasmique. Au cours des der-

déséquilibre dans la signalisation des Jak/STAT

nières années, plusieurs substrats de TC-PTP

contribue au développement de différents dys-

ont été identifiés : Jak/STAT, EGFR, IR, PDGFR

fonctionnements immunitaires [12]. Ainsi, par

et autres [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11] (Tableau I).

l’entremise des substrats qu’elle affecte, TC-

Les Jak/STAT sont particulièrement d’intérêt

PTP joue un rôle de régulateur de l’activation

dans l’analyse du rôle joué par la phosphatase

des cellules du système immunitaire. Égale-

dans la signalisation immunitaire (Figure 2). Un

ment, une délétion de PTPN2 a récemment été

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STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 27

NUMÉRO CRCQ observée chez certains patients atteints de leu-

ce lien entre TC-PTP et le système immunitaire

cémie lymphoblastique aiguë des lymphocytes

en démontrant une association entre un polymor-

T, confirmant ainsi l’implication de TC-PTP dans

phisme nucléotidique (SNP) localisé au locus de

le système immunitaire [13, 14].

PTPN2 (rs2542151) et trois maladies auto-im-

De plus, au cours des dernières années,

munes : le diabète de type 1, l’arthrite rhumatoïde

de nombreuses études génomiques ont renforcé

et la maladie de Crohn [15] (Figure 3 et Tableau II).

Substrats

Type cellulaire

Références

Jak 1 Jak 3 STAT 1

Cellules Cos7

[ 4] Curr Biol 2002, 12:446-453

Cellules 293T Lignée d’ostéosarcome Humaine (U2OS) Hépatocytes

[5] Mol Cell Biol 2002, 22:5662-5668

STAT 3 STAT 5a+5b STAT 6 IR EGFR p52Shc PDGFR CSF-1R Lck Fyn C3G

Cellules épitheliales mammaires (COMMA-1D) Lymphomes diffus à grandes cellules B Cellules 293 Cellules Cos Fibroblastes embryonnaires murins Macrophages Cellules Cos1

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Tableau I Les substrats directs de TC-PTP Ce tableau indique les différents substrats de TC-PTP identifiés grâce à une technique qui consiste à muter la phosphatase d’intérêt afin qu’elle soit catalytiquement inactive mais conserve tout de même sa capacité à lier son substrat. Les cellules dans lesquelles ces substrats ont été identifiés ainsi que les articles de référence sont indiqués.

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Figure 2 Schéma illustrant l’implication de TC-PTP dans les réseaux de signalisation Jak-STAT TC-PTP cible et déphosphoryle les résidus de tyrosine de différents acteurs des réseaux de signalisation Jak-STAT : Jak 1-3, STAT 1-3-5a/b-6. TC-PTP affecte ainsi l’expression de nombreux gènes régulés par ces réseaux.

Figure 3 Localisation des SNP associés à différentes maladies auto-immunes dans le locus de PTPN2 De multiples études génomiques ont identifié plusieurs SNP liés au développement de diverses maladies auto-immunes chez l’humain. Les SNP localisés dans la région chromosomale 18p11 (locus de PTPN2) sont illustrés. (Voir Tableau II pour l’information concernant ces SNP.) Vol.2 n°2

STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 29

NUMÉRO CRCQ

SNP

Position dans le Allèle gène ciblée

Association aux maladies

Références

rs7234029

Intron 1

CD, UC JIA

PLoS ONE 2012, 7(3):e33682

A/G

Arthritis Rheum 2010, 62(11) :3265-76.

rs478582

Intron 3

T/C

T1D, Maladie de Graves

Nature Genetics 2007, 39(7): 857-864.

rs1893217

Intron 7

T/C

T1D, RA, Maladie de Graves JIA

Nature Genetics 2007, 39(7):857-864.

RA

Nature Genetics 2012, 44(5):511-6.

CD, T1D, RA T1D

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rs2847297

Intron 8

A/G

rs2542151

5.5 kb en aval du T/G gène

Arthritis Rheum 2012, 62(11):3265-76.

Tableau II Les SNP localisés au locus de PTPN2 et leurs associations avec différentes maladies auto-immunes Différents SNP liés à diverses maladies auto-immunes chez l’humain ont été localisés au locus de PTPN2 (18p11). Le numéro du SNP, sa localisation dans le locus, l’allèle ciblé, la maladie associée et les articles de référence sont identifiés. CD : maladie de Crohn, UC : colite ulcéreuse, JIA : arthrite idiopathique juvénile, T1D : diabète de type 1, RA : arthrite rhumatoïde.

Caractérisation de la souris génétiquement modifiée déficiente en TC-PTP La première souris knock-out (KO, -/-) pour un

survivent que de trois à cinq semaines. La splé-

gène de la famille des PTP fut la souris PTPN2

nomégalie et la lymphadénopathie observées

générée par notre laboratoire [16]. Ces souris

chez l’animal sont en partie expliquées par une

naissent avec un rapport respectant les règles

augmentation du nombre total de cellules avec

de l’hérédité mendélienne, précisant que la

altération des proportions des différentes lignées

perte de TC-PTP n’est pas létale pour l’embryon.

hématopoïétiques dans ces organes. Ce modèle

Les souris de tous génotypes ne démontrent

murin permet donc d’étudier l’implication de TC-

aucune anomalie sévère à la naissance, et ce

PTP dans le développement et l’activation de

n’est qu’à la deuxième semaine que les souris

différentes lignées hématopoïétiques. Les sou-

KO se démarquent par leur petite taille, leur pos-

ris hétérozygotes pour l’expression de TC-PTP

ture voutée et leurs poils hérissés. Ces souris

démontrent un phénotype semblable aux souris

souffrent d’anémie, d’inflammation sévère, et ne

contrôles dites sauvages (WT).

Vol.2 n°2

STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 30

NUMÉRO CRCQ

TC-PTP et le développement des érythrocytes Comme mentionné précédemment, la souris KO

partiellement expliquée par un stroma déficient

souffre d’anémie. Un bas niveau d’hématocrite

dans la moelle osseuse. De plus, une amplifi-

et une absence d’auto-anticorps IgM dans la cir-

cation de la production de globules rouges est

culation sanguine de l’animal (déterminée par

notée au niveau de la rate, responsable d’une

le test de Coombs) caractérisent cette anémie.

augmentation du volume de la pulpe rouge et

L’analyse histologique de la moelle osseuse

expliquant en partie la splénomégalie observée

démontre une diminution du nombre de cellules

chez l’animal. Ce phénomène indique que la

stromales. L’intégrité de la moelle osseuse étant

rate ne semble pas pouvoir compenser l’incapa-

sévèrement affectée, l’environnement de syn-

cité de la moelle osseuse à assurer une érythro-

thèse des cellules (sécrétions ambiantes et ad-

poïèse appropriée. Ces résultats démontrent

hésions) devient inadéquat à leur bon dévelop-

l’implication nécessaire de TC-PTP dans le dé-

pement. Ainsi, l’érythropoïèse défectueuse est

veloppement des érythrocytes [16].

TC-PTP et les leucocytes myéloïdes Dans la rate des souris homozygotes déficientes

a été démontrée responsable de cette inhibi-

en TC-PTP, la prolifération des lymphocytes T

tion. En stimulant les cellules Gr1+ des souris

est inhibée, mais ce phénomène est en partie

TC-PTP KO avec l’interféron-gamma (IFN-γ),

contré lorsque ceux-ci sont stimulés in vitro [17].

on constate une augmentation des niveaux de

Cette observation a mené à l’étude des diffé-

protéine nitrique oxyde synthase (iNOS) et de

rents groupes cellulaires présents dans la rate

la production d’oxyde nitrique (NO). C’est cette

qui pourraient être responsables de cet effet.

production de NO qui bloque la prolifération des

C’est la population positive pour le marqueur

lymphocytes T, tel que validé par l’utilisation d’in-

Gr1, regroupant les macrophages, les cellules

hibiteurs de NO permettant le rétablissement de

tueuses naturelles (NK) et les neutrophiles, qui

la prolifération des cellules. Il a aussi été noté

Vol.2 n°2

STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 31

NUMÉRO CRCQ

que les macrophages sans TC-PTP, cellules

substrats directs de TC-PTP [19]. CSF-1 étant

appartenant au groupe Gr1+ mentionné, pré-

un facteur de croissance primaire pour la pro-

sentent une augmentation de l’expression du

lifération et la différentiation des macrophages,

marqueur d’activation CD80, signe d’une hype-

l’hyperphosphorylation de CSF1R chez les

ractivation de ces cellules [17].

macrophages TC-PTP -/- semble expliquer leur

L’analyse histologique des tissus des

prolifération dérégulée.

souris TC-PTP -/- permet de constater l’infiltra-

Différents tests clonogéniques utilisant

tion des macrophages aussi bien au niveau des

les cellules progénitrices de la moelle osseuse

tissus lymphoïdes (rate) que non-lymphoïdes

des souris KO ont démontré la préférence de

(reins). Ces tissus possèdent aussi de très

ces dernières à se différencier en lignées mono-

hauts niveaux d’expression d’ARN messagers

nucléaires phagocytaires telles que les macro-

de l’IFN-γ, d’IL12 et de NO, tous d’importants

phages [17]. La perte de TC-PTP mène donc

marqueurs du processus d’inflammation [18].

à une augmentation de la prolifération et de la

Lorsqu’ils sont stimulés aux lipopolysaccha-

sensibilité des macrophages ainsi qu’à une pré-

rides (LPS) in vivo ou in vitro, les macrophages

férence des cellules progénitrices à l’engage-

TC-PTP -/- produisent, tout comme le groupe

ment vers le développement de lignées mono-

de cellules Gr1+ précédemment décrit, de très

cytiques. Par conséquent, TC-PTP assure un

hauts niveaux d’iNOS et de NO. Afin de com-

rôle d’inhibiteur chez cette lignée cellulaire et

prendre l’hypersensibilité des macrophages TC-

prévient l’inflammation qui découle habituelle-

PTP -/-, les mécanismes de signalisation ont été

ment de l’hyperactivation de ces cellules.

étudiés et CSF1R a été identifié comme l’un des

TC-PTP et les leucocytes lymphoïdes : cellules B La moelle osseuse des souris TC-PTP -/- démontre une diminution du nombre total des cellules hématopoïétiques; plus précisément ciblées sont les celVol.2 n°2

lules pré-B, les cellules immatures B et les cellules stromales [16]. Au cours de leur développement STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 32

NUMÉRO CRCQ dans la moelle osseuse, les cellules progénitrices B

est surprenant compte tenu du fait que la perte de

souffrent d’une obstruction durant leur transition de

TC-PTP mène généralement à une augmenta-

petites cellules pré-B à cellules B immatures. Ces

tion de la phosphorylation de ses substrats. Tou-

deux sous-types cellulaires présentent d’ailleurs une

tefois, au niveau des cellules pré-B TC-PTP -/-,

augmentation de l’expression du marqueur de mort

une diminution de l’expression du récepteur IL7

cellulaire Annexin V. Des études de co-culture ont dé-

contribue à cette hypophosphorylation de Jak1 et

montré que l’obstruction observée dans le processus

STAT5. Pour ce qui est des cellules stromales

de maturation des cellules B est expliquée par une

de la moelle osseuse, elles sécrètent de grande

déficience au niveau de l’environnement dans lequel

quantité d’IFN-γ, cytokine reconnue pour dimi-

celles-ci se développent, mais aussi au niveau des

nuer la sensibilité des cellules B à une stimula-

cellules elles-mêmes [20].

tion à l’IL7 [22]. Ainsi, la perte de TC-PTP chez

Les cellules pré-B TC-PTP -/- stimulées

les cellules B mène à une diminution du nombre

in vitro avec l’interleukine 7 (IL7) prolifèrent plus

d’IL7R et à une baisse de sensibilité à l’IL7

lentement que les cellules pré-B WT. En effet, la

causée par l’importante concentration d’IFN-γ

baisse de sensibilité des cellules à l’IL7 est expli-

dans l’environnement. Ces deux phénomènes

quée par une diminution de la phosphorylation des

expliquent la diminution de la prolifération des

facteurs Jak1 et STAT5 qui assurent la signalisa-

cellules B ainsi que le blocage dans leur pro-

tion du récepteur IL7 (IL7R) [21]. Ce phénomène

cessus de maturation.

TC-PTP et les leucocytes lymphoïdes : cellules T L’inflammation systémique observée chez la sou-

absolus de cellules T ne sont pas affectés; par

ris KO mène à une atrophie du thymus. L’ana-

contre, leur pourcentage est diminué en raison

lyse du thymus de ces souris indique une dimi-

de l’augmentation des autres types cellulaires,

nution du nombre de cellules T doubles positives

dont le nombre s’accroît [16].

(DP) mais aucun effet apparent sur les cellules

Comme mentionné précédemment, la

simples positives. Du côté de la rate, les niveaux

capacité de proliférer des cellules T dans la rate

Vol.2 n°2

STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 33

NUMÉRO CRCQ des souris TC-PTP KO est inhibée. Cette capa-

la signalisation du récepteur des cellules T

cité est partiellement restituée lorsque les cel-

(TCR), qui assure la survie et la sélection de

lules KO sont isolées et stimulées in vitro, mais

ce type cellulaire, a été réalisée. TC-PTP joue

les cellules KO sont tout de même encore 2 à

un rôle de régulateur négatif du TCR en inhi-

3 fois moins prolifératrices que les cellules WT

bant la signalisation de certains membres de la

lorsqu’elles sont isolées et stimulées [17]. L’inhi-

famille des kinases Src. Deux importants parti-

bition générée par l’environnement présent dans

cipants de cette signalisation, Lck et Fyn, ont

la rate ainsi que celle notée au niveau de la cel-

été identifiés comme substrats de TC-PTP.

lule T elle-même démontrent un rôle intrinsèque

Cette implication au niveau du TCR affecte

et extrinsèque de TC-PTP dans le développe-

le développement des cellules T, mais aus-

ment des cellules T, tout comme dans celui des

si leur fonction en périphérie. Au niveau du

cellules B. Pour ce qui est des cellules T en

développement dans le thymus, l’induction

périphérie, une augmentation de la proportion

significative du TCR et l’altération de la si-

des lymphocytes T mémoires est notée chez la

gnalisation des cytokines, causée par la perte

souris KO [16].

de TC-PTP, mènent à une augmentation des

Pour décoder le rôle de la phosphatase

cellules T SP CD8+ et CD4+. En périphérie,

au niveau de la prolifération et de l’activation

les ratios de cellules T effectrices et mémoires

des cellules T et éliminer le facteur environne-

sont augmentés, ce qui peut mener à une perte

mental causé par la perte globale de TC-PTP

de la tolérance immunitaire chez l’animal.

chez l’animal, un modèle de souris KO condi-

Ainsi, dans le modèle avec la perte condi-

tionnel a été généré [23]. La perte de TC-PTP

tionnelle de TC-PTP, la phosphatase contribue à

chez cette souris conditionnelle est restreinte

la régulation de la sélection positive des cellules T

aux lymphocytes T et débute dès la formation

durant leur développement dans le thymus sans

des DN. C’est avec ce modèle que l’étude de

affecter la sélection négative. Ce phénomène

l’implication de la phosphatase au niveau de

semble moins présent chez la souris avec un KO

Vol.2 n°2

STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 34

NUMÉRO CRCQ

de TC-PTP généralisé en raison de la déficience

notamment des glucocorticoïdes, modulateurs

stromale qui affecte de nombreux composants,

reconnus des DP.

Conclusion et perspectives En ciblant différentes cascades de signa-

PTP dans le développement et l’activation

lisation, TC-PTP affecte le développement

des lymphocytes T [23].

et l’activation de multiples types cellulaires

Les phénotypes observés dans les diffé-

jouant des rôles majeurs dans le système

rentes cellules immunitaires du modèle de souris

hématopoïétique. La perte totale de la

TC-PTP KO ne font que renforcer les liens entre

phosphatase chez la souris mène à une

PTPN2 et certaines maladies auto-immunes

inflammation généralisée causée en partie

établis par des études génomiques. Déjà, de ré-

par l’hyper-activation des macrophages,

centes études effectuées dans notre laboratoire

à une anémie partiellement expliquée par

ont démontré l’implication de la phosphatase

une moelle osseuse défectueuse et à une

dans le développement de la maladie de Crohn

diminution de la prolifération et de l’activa-

[24] et de l’arthrite rhumatoïde [25]. Toutefois,

t ion des lymphocytes T et B [16]. La souris

plusieurs questions sur les mécanismes de

TC-PTP KO permet de démontrer comment

contrôle influençant l’expression et l’action de

la phosphatase affecte l’environnement

cette tyrosine phosphatase restent à résoudre

des différents types cellulaires en main-

afin de pouvoir utiliser ce gène comme biomar-

tenant une stabilité dans la production et

queur et cible thérapeutique en médecine per-

la réponse des cytokines. Des modèles de

sonnalisée [26]. Notamment, la compréhension

souris KO conditionnel doivent être utilisés

de la fonction anti-inflammatoire de TC-PTP se-

afin de mieux comprendre le phénomène

rait d’une grande aide dans le développement

cellulaire engendré par la perte de TC-PTP,

de traitements spécifiques aux patients possé-

comme démontré par l’étude du rôle de TC-

dant le SNP dans le locus PTPN2.

Vol.2 n°2

STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 35

NUMÉRO CRCQ Remerciements et financements

bué à l’avancement des recherches sur TC-PTP.

Les auteurs remercient le département de biochi-

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’in-

mie de l’Université McGill ainsi que la Société Ca-

térêts concernant les données publiées dans

nadienne du Cancer pour les fonds qui ont contri-

cet article.

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STÉPHANIE BUSSIÈRES-MARMEN ET COLL. 36

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REVUE

Les dynamiques calciques : côté lumineux de la signalisation endothéliale Calcium dynamics: Bright Side of endothelial signalling Chimène Charbel, Fanny Toussaint, Jonathan Ledoux Centre de recherche Institut de Cardiologie de Montréal

Correspondance Jonathan Ledoux, Ph.D. 5000 Bélanger Montréal, Québec, H1T 1C8 Canada 514 376-3330 poste 2476 [email protected]

Date de réception : 31 octobre 2012 Date d’acceptation : 29 avril 2013

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Résumé De nombreuses fonctions endothéliales dépendent du Ca2+ cytoplasmique libre, démontrant l’importance d’un contrôle fin de l’homéostasie calcique. La signalisation calcique endothéliale présente d’importantes dynamiques avec des cinétiques et une distribution intracellulaire distinctes. D’une part, les dynamiques calciques « globales » consistent en d’importantes variations cytoplasmiques de Ca2+ libre prenant fréquemment la forme de vagues calciques. D’autre part, de récentes études ont caractérisé des dynamiques calciques présentant une propagation spatiale limitée. Les Ca2+ blips, puffs, wavelets, sparklets ainsi que les pulsars calciques sont définis par une faible dispersion et une distribution intracellulaire unique. Les rôles physiologiques potentiels de ces dynamiques calciques endothéliales engendrent un intérêt marqué pour l’élucidation des mécanismes régulateurs de ces dynamiques.

Summary Fine-tuning of endothelial Ca2+ homeostasis is critical for the numerous Ca2+-dependent endothelial functions. Intracellular Ca2+ signalling found in endothelial cells is highly dynamic and shows distinct kinetics and intracellular distributions. Global Ca2+ dynamics are characterized by an increase in Ca2+ levels throughout the cytoplasm and generally associated with Ca2+ waves. On the other hand, recent studies showed intracellular Ca2+ dynamics with limited propagation. These Ca2+ blips, puffs, wavelets, sparklets and pulsars are characterized by a limited spreading of the Ca2+ signal and a unique intracellular localization. Growing interest in the elucidation of the regulatory mechanisms of these endothelial Ca2+ dynamics is prompted by their potential physiological roles.

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 39

NUMÉRO CRCQ

C’

est en 1980 que le Dr Robert

rose et l’hypertension artérielle a clairement été

F. Furchgott a levé le voile sur

établie [2, 3].

l’importance de l’endothélium

Le développement d’indicateurs fluo-

dans la fonction vasculaire [1]. Jusqu’alors,

rescents (Indo-1, Fura-2) par le groupe du Dr

l’endothélium n’était perçu qu’en tant que mo-

Roger Y. Tsien a permis l’étude de l’homéosta-

nocouche cellulaire formant une simple bar-

sie calcique [4]. De plus, l’accessibilité grandis-

rière physique passive. Cette étude pionnière

sante de la microscopie confocale et de nou-

marqua une nouvelle ère, où l’endothélium est

veaux indicateurs (Fluo-4) [5] ont accru l’intérêt

dorénavant reconnu comme un élément central

envers la caractérisation de l’homéostasie cal-

de la fonction vasculaire. Outre le contrôle du

cique endothéliale. Les protéines responsables

tonus vasculaire, l’endothélium est un acteur

de l’homéostasie calcique sont situées tant au

prépondérant de l’angiogenèse, de la perméa-

niveau de la membrane plasmique que du réti-

bilité vasculaire et de la réponse inflammatoire.

culum endoplasmique (RE). Le RE, à titre de

Ces différentes fonctions ont en commun leur

réserve intracellulaire de Ca2+ séquestre une

dépendance envers le calcium intracellulaire,

importante quantité de Ca2+ (environ 500 μM,

attestant donc de l’importance de l’homéosta-

[6]) et permet sa libération rapide et potentielle-

sie calcique endothéliale. D’ailleurs, une per-

ment très circonscrite via les récepteurs à l’IP3

turbation de l’homéostasie calcique se traduit

(IP3Rs). D’autre part, les cellules endothéliales

par une altération des fonctions endothéliales,

(CEs) expriment à la membrane plasmique plu-

notamment la régulation du tonus vasculaire,

sieurs canaux perméables au Ca2+ tels que

entre autres via la synthèse d’oxyde nitrique

les canaux ORAI1 et « transient receptor po-

(NO) et de facteurs hyperpolarisants dérivés de

tential » (TRP), permettant un influx calcique.

l’endothélium (EDHF). En effet, la corrélation

Inversement, des pompes ATPase (PMCA à la

entre la dysfonction endothéliale et les mala-

membrane plasmique et SERCA au RE) ainsi

dies cardiovasculaires telles que l’athérosclé-

que des échangeurs sodium/calcium (NCX)

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 40

NUMÉRO CRCQ

permettent d’expulser le Ca2+ du cytoplasme

cale représente en tant que cible thérapeutique

et de maintenir un niveau relativement faible

potentielle aux pathologies vasculaires. En

(Ca2+ intracellulaire libre ≈ 100 nM). Une clas-

effet, plusieurs pathologies cardiovasculaires

sification des dynamiques calciques endothé-

semblent intimement liées à une dysfonction en-

liales en fonction de la ségrégation du signal

dothéliale associée à une perturbation de l’ho-

permet d’établir deux catégories : les variations

méostasie calcique (revue [7, 8]). Par exemple,

globales et locales de Ca2+ libre intracellulaire.

une dyshoméostasie calcique endothéliale est

Ces deux catégories se distinguent principale-

associée à l’inflammation chronique, l’hyperten-

ment par la dispersion et la durée du signal cal-

sion, le diabète et l’athérosclérose [9-14]. Des

cique, puisqu’elles impliquent essentiellement

composantes majeures de l’homéostasie cal-

les mêmes effecteurs. De plus, la signalisation

cique endothéliale telles que les TRP, SERCA

calcique globale est généralement stimulée par

et IP3Rs ont par ailleurs été intimement liées à

un agoniste tel que l’acétylcholine (ACh) ou bra-

l’hypertension [15]. Les dynamiques calciques

dykinine (Bk) alors que la signalisation locale

globales constituent donc un élément inhérent

est spontanée. Notons toutefois que des ago-

à l’étude des pathologies vasculaires. D’autre

nistes peuvent évidemment stimuler ou moduler

part, de récentes évidences suggèrent un rôle

les dynamiques calciques locales.

physiologique important de la signalisation cal-

Cet article tentera d’établir l’essentiel de

cique locale, mais une corrélation directe avec

ces signalisations tout en soulignant le carac-

les différentes pathologies cardiovasculaires

tère excitant de la recherche dans ce domaine

reste à identifier.

et l’aspect prometteur que la signalisation lo-

Signalisation globale L’importance primordiale de la régulation de la

([Ca2+]i) pour de nombreuses fonctions endo-

concentration intracellulaire globale en Ca2+

théliales est démontrée par l’implication de

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 41

NUMÉRO CRCQ

plusieurs processus physiopathologiques. Par

vera des IP3Rs adjacents [21] et génèrera ainsi

exemple, les forces de cisaillements engendrées

une succession d’activation de IP3R constituant

par le flux sanguin ou encore le stress oxydant

des « vagues calciques » [18, 22] (Figure 1).

participent à la régulation du Ca2+ global [16,

Une importante augmentation du [Ca2+]i lors de

17]. L’homéostasie calcique globale de l’endo-

la phase initiale résulte en la déplétion des ré-

thélium est donc une thématique de recherche

serves en Ca2+ du RE. Cette déplétion active le

cardiovasculaire incontournable. L’étude des

processus appelé SOCE (Store-Operated Ca2+

dynamiques calciques endothéliales fut d’abord

Entry), responsable du maintien de l’augmenta-

concentrée sur la caractérisation de l’augmen-

tion globale en [Ca2+]i lors de la seconde phase

tation globale de Ca2+ induite par des ago-

par l’activation d’un influx soutenu en Ca2+

nistes endothéliaux (acétylcholine, bradykinine,

d’origine extracellulaire. De récentes études

etc.) [18]. L’augmentation du [Ca2+]i induite par

suggèrent qu’une combinaison de canaux

ces agonistes présente un patron temporel de

ORAI1 et TRP seraient responsables de cet

type biphasique. La première phase correspond

influx calcique [23-25] (Figure 1). Par ailleurs,

à une augmentation marquée et rapide mais

les mécanismes physiologiques responsables

transitoire du Ca2+, suivie d’une phase plus

du contrôle du tonus vasculaire sont notamment

longue où le [Ca2+]i est maintenu au-dessus

activés par une augmentation globale en Ca2+.

des valeurs initiales. Brièvement, l’activation

Effectivement, l’augmentation globale de Ca2+

des récepteurs membranaires par les agonistes

induite par les agonistes endothéliaux active

endothéliaux, principalement couplés aux pro-

la NO synthase d’origine endothéliale (eNOS)

téines G, induit la formation d’IP3 [19]. Il en

[26] engendrant la production de NO, puissant

résulte alors l’activation rapide de récepteurs à

vasodilatateur [9, 27]. L’EDHF, un ensemble de

l’IP3 (IP3Rs) du RE qui engendre une « libéra-

différents mécanismes parfois complémentaires

tion de Ca2+ induite par le Ca2+ »[20]. En effet,

qui provoque l’hyperpolarisation et la relaxa-

la libération de Ca2+ par quelques IP3Rs acti-

tion des cellules musculaires lisses vasculaires

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Figure 1. Signalisation calcique globale de l’endothélium vasculaire La signalisation calcique globale débute généralement par la liaison d’un agoniste, tel que l’acétylcholine, à son récepteur membranaire couplé aux protéines G (1). Cette activation mène à la production d’IP3 via la phospholipase C (PLC), permettant l’activation des récepteurs à l’IP3 (IP3Rs) et la libération du Ca2+ contenu dans le RE (3). La Ca2+ libéré par quelques IP3Rs activera par la suite des récepteurs adjacents (libération de Ca2+ induite par le Ca2+) générant ainsi une vague calcique (4). Cette vague calcique peut également dans un second temps provoquer une déplétion du RE en Ca2+ (5). Cette chute du niveau de Ca2+ du RE induit un changement de conformation de STIM1 (6) permettant un rapprochement de la membrane plasmique et donc l’activation des canaux perméables au Ca2+ tels que les TRP et ORAI (7). Il en résulte alors une augmentation générale du Ca2+ cytoplasmique libre. RCPG : Récepteur couplé aux protéines G, PLC : Phospholipase C, IP3 : Inositol 1,4,5-triphosphate, Ca2+ : Calcium, IP3Rs : Récepteurs à l’IP3, Extra. : Milieu extracellulaire, Cyto. : Milieu cytoplasmique.

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CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 43

NUMÉRO CRCQ

(CMLVs), ainsi que la prostacycline (PGI2), sont

dans l’EDHF [28, 29] (revue [30]). L’hyperpolari-

également tributaires du [Ca2+]i. Il a en outre

sation des CEs ainsi induite par l’augmentation

été suggéré que l’activation des canaux potas-

globale du Ca2+ libre est ensuite transmise via

siques Ca2+-dépendant (Kca2.3, Kca3.1) loca-

les jonctions Gap aux CMLVs sous-jacentes,

lisés à la membrane plasmique serait impliquée

engendrant ainsi leur relaxation [29].

Signalisation calcique locale Bien que les études de la signalisation calcique

tique de Ca2+ via les IP3Rs. Il est toutefois

endothéliales aient été originalement dirigées

clair que l’intensité du signal varie en fonction

sur la compréhension des variations globales

de la concentration cytoplasmique et locale en

du niveau de Ca2+ libre cytoplasmique, il appa-

IP3, probablement responsable des différences

raît désormais que des modifications locales de

entre les types de signaux locaux. À de faibles

la concentration en Ca2+ libre peuvent avoir un

concentrations en IP3, l’ouverture d’un seul

impact important sur la fonction endothéliale.

IP3R provoque les « Ca2+ blips » (Figure 2.A)

Ce type de signalisation calcique est caracté-

[31, 32, 34, 35]. Les Ca2+ blips sont sponta-

risé par des augmentations de Ca2+ sponta-

nés, ne durent qu’environ 100 msec, présentent

nées et transitoires avec une dispersion limitée.

une amplitude d’environ 23 nM dans les CEs

Cette faible propagation du signal, accompa-

en culture d’artères pulmonaires bovines [36] et

gnée d’une localisation intracellulaire définie

sont probablement présents dans tous les types

et précise, permettrait de moduler finement les

d’endothéliums [37, 38]. Une concentration

fonctions cellulaires [31-33]. En effet, plusieurs

légèrement supérieure en IP3 ou en Ca2+ en-

types d’événements calciques locaux se dis-

gendre le recrutement de quelques IP3Rs grou-

tinguent par leurs amplitudes et durées, mais

pés, générant ainsi un « Ca2+ puff » [35, 36].

également par leur localisation particulière.

Ces « Ca2+ puffs » ont une durée ≤1 sec et une

La signalisation calcique locale est gé-

amplitude supérieure (50 à 100 nM) à celle des

néralement initiée par une libération stochas-

Ca2+ blips, sans toutefois déclencher une pro-

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 44

NUMÉRO CRCQ Figure 2. Signalisations calciques locales de l’endothélium vasculaire

Vol.2 n°2

(A) Les « Ca2+ blips » et « Ca2+ puffs ». Le Ca2+ blips résulte de l’activation d’un seul IP3R, provoquant une sortie Ca2+du RE. De plus fortes concentrations d’IP3, favorisent le recrutement de plusieurs IP3Rs et engendre l’apparition de Ca2+ puffs. (B) Les « Ca2+ wavelets ». Les wavelets apparaissent à proximité des PMEs, permettant ainsi une communication intime entre les CEs et les CMLs. L’ouverture des IP3Rs du RE localisés dans les PMEs engendre une augmentation localisée de Ca2+. Les wavelets vont donc activer les canaux Kca2.3 et 3.1, hyperpolarisant ainsi les CEs. La présence de jonctions communicantes Gap au niveau des PMEs permet la transmission de l’hyperpolarisation des CEs aux CMLs, provoquant une vasodilatation. (C) Les « Ca2+ sparklets ». L’influx de Ca2+ du milieu extracellulaire dans la CE via les canaux TRPV4, localisés aux extrémités de la cellule et dans les PMEs. Cette augmentation de Ca2+ localisée peut activer les canaux Kca2.3 et 3.1, engendrant une hyperpolarisation des CEs qui est transmise aux CMLs via les jonctions communicantes Gap. Cette signalisation calcique peut également être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire. (D) Les pulsars calciques. Les pulsars calciques se distinguent par leur augmentation de Ca2+ circonscrit dans les PMEs. Cette caractéristique lui permet d’être impliqué dans la régulation du tonus vasculaire en ciblant des protéines localisées à l’intérieur de ces projections. L’activation des canaux KCa3.1 génère une hyperpolarisation des CEs transmise aux CMLs, provoquant une vasodilatation. La régulation du tonus vasculaire se fait également par la production de NO, stimulée suite à l’activation et le recrutement de CaMKII au niveau de PMEs. R : Récepteur, Ca2 : Calcium, K : Potassium, IP : Inositol 1,4,5-triphosphate, IP3R : Récepteurs à l’IP3, Kc : Canaux potassiques calcium-dépendant, TRPV : Transient Receptor Potential Channel » de la famille des Vanilloïdes, CaMKI : Protéine Kinase II dépendante du complexe calcium/ calmoduline, eNO : oxyde nitrique synthase d’origine endothéliale, N : oxyde nitrique, PME : Projections myoendothéliales.

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 45

NUMÉRO CRCQ

pagation du signal dans la cellule (Figure 2.A)

interrompue résultant de l’ouverture de IP3Rs

[35, 36]. Enfin, le recrutement de plusieurs

[40]. Cette augmentation de Ca2+ libre s’avère

de ces événements ou d’un nombre accru de

d’amplitude plus élevée que celle des Ca2+

IP3Rs pourrait être l’élément déclencheur de

puffs (Figure 2B) [33, 40]. Tran et coll. suggèrent

vagues calciques, tel que décrit dans la section

que les wavelets participent au contrôle du to-

précédente [32, 35, 39]. Il est important de ne

nus vasculaire dans les artères nourrissant le

pas limiter l’étude de ces dynamiques calciques

muscle squelettique [40]. Les wavelets sont lo-

à leur fonction de précurseurs d’une signalisa-

calisés à proximité des projections myoendothé-

tion calcique globale. Le rôle fondamental des

liales (PMEs), structures formées de projections

Ca2+ blips et Ca2+ puffs dans les processus

cellulaires entre les CEs et les CMLVs [40]. Ces

physiologiques tels que l’exocytose ou encore

PMEs permettent une communication intime

l’activation de certains canaux ioniques [31-33]

entre les deux types cellulaires [40, 41] par la

est sans équivoque. La restriction spatiale du

présence de jonctions communicantes de type

signal calcique observée dans ces événements

Gap facilitant l’échange de seconds messagers

permet de cibler des protéines importantes pour

tels que l’IP3 et le Ca2+ [42, 43]. Ces PMEs re-

la régulation de différents processus cellulaires

présentent donc un lieu privilégié d’interactions

endothéliaux, sans affecter l’ensemble des

bidirectionnelles entre les CEs et les CMLVs.

mécanismes sensibles au Ca2+, ce qui repré-

Généralement, la signalisation calcique

sente un atout considérable. Cette spécificité du

locale consiste en des libérations du Ca2+

signal présente également un avantage énergé-

contenu dans le RE. Exception à la règle et pré-

tique important puisque moins de protéines et

cédemment identifiés dans les cellules muscu-

d’ions sont nécessaires dans une action locale

laires lisses et cardiaques grâce au TIRF (fluo-

pour générer un effet équivalent.

rescence à réflexion totale interne ; permet la

Récemment identifié, le « Ca2+ wave-

visualisation d’influx calcique directement sous

let » est défini comme étant une vague calcique

la membrane [44]), les « Ca2+ sparklets » ont

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 46

NUMÉRO CRCQ

récemment été observés dans l’endothélium

Parmi les dynamiques calciques endo-

d’artères mésentériques de souris (Figure 2.C)

théliales traitées dans cet article et présentant

[45]. Les sparklets résultent de l’ouverture d’un

une localisation intracellulaire définie (wavelets

canal pour permettre l’influx de Ca2+ dans le cy-

et sparklets), le pulsar calcique fut historique-

toplasme. Contrairement aux sparklets des myo-

ment le premier identifié. Les pulsars résultent

cytes, les sparklets endothéliaux ne résultent

de l’activation spontanée de IP3Rs situées dans

pas de l’ouverture de canaux Ca2+ voltage-dé-

les PMEs et peuvent être impliqués dans la régu-

pendants, mais plutôt du canal cationique peu

lation du tonus vasculaire (Figure 2.D) [47]. Les

sélectif TRPV4 [45]. Ce canal TRP de la famille

cinétiques et fréquences des pulsars diffèrent

des Vanilloïdes est exprimé à la membrane plas-

des autres signalisations calciques locales (ta-

mique d’artères de résistance. Il est intéressant

bleau 1). Les pulsars représentent en fait la pre-

de noter une distribution préférentielle de ces

mière évidence évoquant une architecture intra-

canaux TRPV4 dans les extrémités et les PMEs

cellulaire permettant une signalisation calcique

des cellules endothéliale [45]. Le Ca2+ péné-

locale structurée et répétitive. Cette signalisa-

trant la cellule via ces sparklets endothéliaux (ou

tion présente l’avantage important de moduler

TRPV4-sparklets) [46] active les canaux KCa2.3

des voies de signalisation sensibles au Ca2+

et KCa3.1, ce qui provoque l’hyperpolarisation

dans ces régions cellulaires définies, sans pour

de la membrane des CEs [45]. Sonkusare et coll.

autant affecter les autres fonctions cellulaires

suggèrent donc que ces sparklets participent à

telles que la régulation génique. D’ailleurs,

la vasodilatation artérielle via une hyperpolarisa-

leur localisation suggère un rôle prépondérant

tion transmise aux CMLs par les jonctions Gap

dans le contrôle du tonus vasculaire via l’acti-

[45]. Ainsi, les sparklets contribueraient signifi-

vation de canaux KCa3.1 [47, 48]. En effet, ces

cativement au contrôle du tonus vasculaire par

canaux potassiques, composante majeure de

leur contribution à l’EDHF, ayant ainsi un impact

l’EDHF, sont également situés dans ces PMEs

physiologique potentiellement important.

et peuvent mener à l’hyperpolarisation des cel-

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 47

NUMÉRO CRCQ

Durée (s)

Surface (μm2)

Amplitude (F/F0)

Ca blips[36]

0,100

1-3

0,3

Ca2+ puffs[35]

1,00

2-4

50-500 (nM)

Wavelets[40]

0,48

51,61

Sparklets[45]

0,037

11,2

0,19-0,29

Pulsars calciques[47]

0,257

15,9

1,77

2+

-

Tableau 1. Comparaison entre les caractéristiques des différentes signalisations calciques iocales Les valeurs publiées proviennent des cellules endothéliales en culture pour les Ca2+ blips, des oocytes de Xenopus pour les Ca2+ puffs, des cellules endothéliales d’artères de muscle squelettique de rat pour les wavelets, des cellules endothéliales d’artères mésentériques de souris pour les sparklets et les pulsars calciques.

lules musculaires lisses via les jonctions Gap

le Ca2+ et localisées dans les PMEs [49]. Par

ou par la génération d’un « nuage potassique ».

exemple, la protéine kinase II dépendante du

En effet, les pulsars calciques hyperpolarisent

complexe calcium/calmoduline (CaMKII) est

la membrane plasmique endothéliale par l’acti-

une enzyme possédant la capacité unique de

vation de canaux KCa3.1 [47].

décoder les différentes oscillations calciques

Toutefois, puisque ces dynamiques cal-

intracellulaires [50]. Une signalisation calcique

ciques locales ont récemment été identifiées,

telle que le pulsar pourrait donc être un activa-

peu d’informations sont disponibles sur leurs

teur de CaMKII, advenant sa localisation dans

mécanismes régulateurs. D’autre part, outre

les PMEs. De plus, le niveau d’activation et

l’impact des sparklets et des pulsars sur la mem-

donc les cibles de CaMKII pourraient varier se-

brane plasmique endothéliale, des rôles physio-

lon la fréquence de pulsars. La stimulation des

logiques supplémentaires de ces signalisations

pulsars calciques engendre d’ailleurs un recru-

demeurent à être caractérisés. Néanmoins,

tement de CaMKII au niveau des PMEs associé

outre les canaux KCa3.1, les pulsars calciques

à une augmentation de la production de NO, qui

peuvent cibler d’autres protéines activées par

serait en partie CaMKII-dépendante [49]. Ainsi,

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 48

NUMÉRO CRCQ les pulsars calciques joueraient un rôle physio-

par l’activation de CaMKII. Il reste désormais à

logique important au niveau de la régulation du

identifier les mécanismes contrôlant ces signali-

tonus vasculaire en agissant sur le potentiel

sations calciques locales et les autres voies de

membranaire, via l’activation de KCa3.1, mais

signalisation qu’elles modulent.

également en modulant la production de NO

Conclusion Le Ca2+, ssecond messager fondamental et

local impliquent généralement la voie de l’IP3

élément essentiel à la fonction cellulaire, joue

pour provoquer une augmentation localisée de

un rôle prépondérant dans le contrôle du tonus

Ca2+ avec des amplitudes et des durées diffé-

vasculaire. Afin d’exercer un contrôle fin, les

rentes caractéristiques. (Tableau 1). Toutefois,

CEs sont pourvues d’une variété de signalisa-

aucune méthode quantitative ne permet actuel-

tions calciques ayant de cinétiques et des dis-

lement de quantifier la concentration en Ca2+i

tributions différentes. Ces caractéristiques leur

libre impliqué dans ces signalisations calciques

permettent de jouer des rôles complémentaires

endothéliales. D’autre part, leur vraisemblable

et ainsi de moduler finement les fonctions endo-

importance dans la régulation du tonus vascu-

théliales. Alors qu’une augmentation globale et

laire représente un attrait supplémentaire favo-

soutenue du Ca2+ intracellulaire endothélial a

risant l’étude spécifique de chacune des signali-

fait l’objet d’études depuis quelques décennies,

sations calciques locales. En effet, ces signaux

un intérêt grandissant est concentré sur les dy-

calciques de plus faibles amplitudes peuvent

namiques calciques locales (Ca2+ blips, Ca2+

générer une réponse physiologique aussi im-

puff, Ca2+ wavelets, Ca2+ sparklets et pulsars

portante que la signalisation globale, puisque

calciques). Les différents types de dynamiques

focalisés. Ces mécanismes permettent donc un

calciques (globales ou locales) peuvent em-

avantage considérable au niveau de l’économie

prunter des voies similaires. Semblables aux

d’énergie de la cellule, les protéines spécifiques

vagues calciques, les signalisations de type

localisées à proximité de ces signaux peuvent

Vol.2 n°2

CHIMÈNE CHARBEL ET COLL. 49

NUMÉRO CRCQ avoir un impact important sur les fonctions cellu-

cique locale demeure à déterminer en condi-

laires. Ces signalisations sont donc impliquées

tions pathologiques. De par le rôle potentiel

dans le maintien de l’équilibre contraction-re-

important de ces dynamiques, il est fort pro-

laxation au niveau vasculaire, mais les méca-

bable qu’une altération des caractéristiques des

nismes contrôlant ces dynamiques demeurent

signalisations locales soit présente en patholo-

à explorer. Par ailleurs, les voies de signalisa-

gie vasculaire. Ces voies de signalisation loca-

tions activées par ces dynamiques locales ont

lisées représentent donc d’intéressantes ave-

été peu caractérisées jusqu’à présent. Des évi-

nues de cibles thérapeutiques potentielles pour

dences montrent toutefois que CaMKII est un

le traitement de pathologies vasculaires telles

candidat idéal pour décoder ces variations de

que l’hypertension.

Ca2+. De plus, l’impact de la signalisation cal-

Remerciements et financements Ce travail fut possible grâce au soutien des organismes subventionnaires IRSC, FRQS et FMCC.

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REVUE

Les granules de stress à ARN : une question de vie ou de mort Stress Granules: A matter of life and death Laetitia Coudert, Rachid Mazroui Département de Biologie Moléculaire, Biochimie Médicale, et Pathologie, Faculté de Médecine, Université Laval, Centre de Recherche CHUQ /St-François d’Assise

Correspondance Rachid Mazroui 10, rue de l’Espinay Québec, Québec, G1L 3L5 Canada 418 525-4444 poste 53752 [email protected]

Date de réception :

6 novembre 2013

Date d’acceptation : 28 janvier 2013

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LAETITIA COUDERT ET COLL. 53

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Résumé Suite au stress, les cellules eucaryotes activent des mécanismes de défense pour s’adapter aux conditions extrêmes imposées par le stress, leur permettant de survivre. Un des mécanismes de défense activés en conditions de stress implique la formation de « granules de stress (SG) » correspondant à des corps cytoplasmiques où des ARNm sont recrutés en condition de stress. La séquestration de certaines molécules de signalisation dans les SG inactive des voies de mort cellulaire, permettant la survie cellulaire. Les SG permettent aussi la protection des ARNm codant pour des fonctions de survie. Une fois le stress éliminé, les ARNm protégés ainsi accumulés sont massivement traduits en protéines de survie assurant la survie cellulaire. Les SG apparaissent donc comme des entités pro-survie, qui, dans le contexte du processus cancéreux peuvent promouvoir la résistance au stress induit par les traitements thérapeutiques, induisant une chimiorésistance. Dans cette revue, les mécanismes de formation des SG sont discutés ainsi que leur rôle dans le contexte de la résistance des cellules cancéreuses aux traitements thérapeutiques.

Summary When exposed to environmental stresses, cells rapidly activate pathways that induce a coordinated response of mRNA translation and turnover that confers protection against stress-induced damage and promotes their survival. One of these pathways involves the induction of stress granules (SG); cytoplasmic bodies where specific mRNAs and proteins are recruited. The sequestration of specific signaling molecules, in SG, could inactivate cellular death programs, leading to the cellular survival. SG can also assure the protection of mRNAs coding for survival functions. Once the inducing stress is relieved, accumulated mRNAs are massively translated in proteins, leading to cellular survival. SG seem thus to play key role in cell resistance to stress. Recent advances suggest that the pro-survival function of SG could account for resistance of cancer cells to the stress generated by chemotherapy, inducing chemoresistance. In this review, we discuss recent advances of the role played by SG in promoting cancer cells resistance to therapeutic conditions as well as the molecular mechanisms leading to their formation.

Vol.2 n°2

LAETITIA COUDERT ET COLL. 54

NUMÉRO CRCQ

La formation des granules de stress : un événement évolutif et conservé

L

es granules de stress (SG) sont des en-

tion évolutive de la formation des SG témoigne

tités cytoplasmiques non-membranaires

d’un rôle important de leur formation dans la

généralement associées au réseau de

réponse cellulaire au stress.

microtubules. Les SG appartiennent à la famille

La formation des SG chez les cellules de mam-

des granules à ARN [1] qui sont connus comme

mifères fut observée en réponse à plusieurs

étant des sites de stockage des ARNm. À la dif-

types de stress. Ceux-ci incluent le choc ther-

férence des autres granules à ARN, les SG ne

mique et le stress oxydatif [8], l’infection virale

sont détectées qu’en condition de stress, sug-

[9], les radiations ionisantes [10] ainsi que les

gérant un rôle spécifique de la formation des SG

traitements chimiothérapeutiques [11]. Dans

dans les conditions de croissance cellulaire dé-

la plupart de ces études, la formation des SG

favorables. La formation des SG est conservée

fut présentée comme un événement important

entre les espèces. On peut les observer chez

permettant une survie cellulaire face au stress.

les chloroplastes de plante [2], les levures Sac-

Nous avons montré, dans le cas du stress gé-

charomyces cerevisiae [3] et Saccharomyces

néré par les drogues anticancéreuses, que la

pombe [4], chez le protozoaire Trypanosoma

formation des SG engendrait une résistance

brucei [5] ainsi que chez le métazoaire Caeno-

des cellules cancéreuses à la mort cellulaire,

rhabditis elegans [6]. On retrouve aussi les SG

constituant ainsi un mécanisme de résistance

chez la Drosophila melanogaster, tel que dé-

thérapeutique [11, 12]. La majorité des stress

montré récemment par notre laboratoire, réité-

induisant la formation des SG inhibent l’initiation

rant les observations du laboratoire de P. Silver

de la traduction des ARNm. Dans ce contexte,

[7]. De plus, nos résultats récents montrent pour

il fut suggéré que les SG pouvaient servir de

la première fois la formation de SG au sein de

sites où les ARNm sont stockés, sous forme

tissus isolés de la drosophile. Cette conserva-

non-traduite. Une fois le stress éliminé, les SG

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NUMÉRO CRCQ

se désassemblent et relâchent ces ARNm qui

de survie, permettant à la cellule de recouvrir

peuvent être rapidement traduits en protéines

du stress subit.

Composition et rôle des SG dans le contrôle de l’expression des ARNm Les SG sont très dynamiques ; leurs composantes

des oligos-dT) que plus de 70 % des ARNm to-

y entrent et sortent continuellement comme l’ont

taux sont recrutés au niveau des SG formées

démontrées les études de photoblanchissement

dans les cellules de mammifères en condition de

(Figure 1). Ce dynamisme a rendu difficile la ca-

stress. Cependant, seule une dizaine d’ARNm

ractérisation biochimique des SG. La quasi-totalité

a été formellement localisée par hybridation in

des composantes des SG fut identifiée par des

situ spécifique au niveau des SG. Cette catégo-

études de localisation cellulaire. On distingue deux

rie inclue les ARNm de c-Myc et de beta-actine

types de composantes des SG: les composantes

[21], de GAPDH [12, 21], des transcripts régu-

‘’core’’ et les molécules de signalisation qui sont

lés par HIF-1 [10], et des ARNm TOP codant les

recrutées aux SG par le biais des composantes

protéines ribosomales [22]. La localisation de

core [1, 13, 14]. Les composantes core des SG

ces ARNm au niveau des SG corrèle avec leur

incluent les facteurs d’initiation de la traduction [8,

accumulation. Récemment, on a démontré que

15-18] et les petites sous-unités ribosomales [19,

la localisation de l’ARNm codant pour la protéine

20]. Les grandes sous-unités ribosomales ainsi

p21 est quantitativement (~80 %) recrutée au

que certains facteurs d’élongation de la traduction

niveau des SG (Figure 2), où il s’accumule suite

sont absents des SG. Ceci exclue la possibilité

à sa stabilisation [12]. La suppression des SG

que les SG soient des sites de la traduction active

prévient la stabilisation de l’ARNm p21, indui-

des ARNm ; les SG seraient plutôt des sites où la

sant ainsi sa dégradation rapide. Ces résultats

traduction des ARNm est réprimée.

démontrent un rôle important des SG dans la

Des études menées par plusieurs laboratoires ont

protection de la dégradation de certains ARNm,

déterminé grâce à l’hybridation in situ (en utilisant

principalement ceux ayant une très courte durée

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Figure 1 Les SG sont dynamiques. Les cellules HeLa exprimant le marqueur GFP-FMRP des SG ont été traitées avec l’arsenite pour induire la formation des SG. Les SG ont été ‘’photoblanchis’’ à l’aide de lasers (A ; la zone photoblanchie est indiquée par une flèche). L’intensité de la fluorescence récupérée après le ‘’photoblanchiment’’ est ensuite mesurée (B). Noter que le recouvrement de 50% de la fluorescence se fait en moins d’une minute, démontrant un va et viens rapide des composantes des SG. Analyse produite au sein de notre laboratoire.

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Figure 2 Bortezomib induit l’accumulation de l’ARNm p21 dans les SG comme démontré par la fluorescence locale (FISH). Les cellules HeLa ont été traitées avec le bortezomib (2 μM) pour induire la formation des SG. Après fixation et perméabilisation, les cellules ont été incubées avec une sonde ARN anti-sens marquée au Alexa fluor 488 pour détecter l’ARNm p21, ou avec une sonde contrôle sens marquée avec de l’Alexa fluor 488. Les SG ont été détectées en utilisant des anticorps spécifiques de la protéine du retard mental fragile X (Fragile X Mental Retardation Protein; FMRP), l’un des marqueurs des SG. Le pourcentage des SG contenant l’ARNm p21 est indiqué.

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de vie, induisant leur accumulation en condition

protéine permettant la dégradation des ARNm

de stress. La localisation des ARNm labiles

dans le cytoplasme des cellules en condition

dans les SG serait donc un événement critique

de croissance normale [25, 26]. La localisation

permettant à ces ARNm d’échapper à l’action

de CUGBP1 dans les SG paraît donc critique

de la machinerie de dégradation des ARNm.

pour la stabilisation de ses ARNm cibles tels

Dans ce contexte, il est important de noter que

que p21. La localisation dans ces granules des

la plupart des enzymes de dégradation des

protéines liant l’ARN pourrait donc jouer un rôle

ARNm sont exclues des SG. Les SG serviraient

clé dans l’accumulation de leurs ARNm cibles

donc de barrière physique contre les enzymes

en induisant leur localisation au niveau de ces

de dégradation des ARNm, ce qui favoriserait

mêmes SG. Il serait surprenant cependant que

la stabilisation des ARNm labiles présents dans

CUGBP1 soit le seul facteur responsable de

les SG [18, 23]. Des analyses à grande échelle

l’accumulation de l’ARNm p21 dans les SG. Des

d’expression du génome des cellules ne pou-

études futures sont nécessaires pour détermi-

vant pas former les SG devraient aider à identi-

ner comment les ARNm spécifiques, incluant

fier les ARNm dont l’accumulation dépend de la

celui codant pour p21, sont stabilisés au niveau

formation des SG.

de ces granules.

En accord avec le concept de la protection de

En plus des protéines stabilisatrices des ARNm,

la dégradation des ARNm labiles par les SG,

certaines composantes des SG sont connues

plusieurs protéines connues comme étant sta-

comme étant inhibitrices de la traduction, ce

bilisatrices d’ARN se retrouvent dans les SG.

qui supporte l’hypothèse selon laquelle les SG

Celles-ci incluent HuR [24], FMRP [20], et TIA

servent de sites de répression de la traduction.

[8]. On a démontré que la protéine CUGBP1

Cette hypothèse fut cependant défiée par une

est responsable de la localisation de l’ARNm

étude récente réalisée chez la levure [3]. En ef-

p21, induisant son accumulation dans les SG

fet, les auteurs ont montré que des souches de

[12]. CUGBP1 fut par contre décrite comme une

levure mutantes, incapables de former les SG,

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NUMÉRO CRCQ

ont maintenu leur capacité à réprimer la traduc-

montré que le traitement court (4 h) des cellules

tion des ARNm en condition de stress. Ce résul-

avec des inhibiteurs de protéasome induit la

tat n’exclut cependant pas que les SG soient

formation des SG, où l’ARNm p21 s’accumule.

importantes pour la répression de la traduction

La séquestration de cet ARNm dans les SG

des ARNm de façon spécifique. Dans ce sens,

empêche cependant son expression comme

on a pu établir un modèle cellulaire (Figure 3)

le démontrent nos analyses en western blot.

pour vérifier l’implication des SG dans la régu-

L’ARNm p21 ainsi accumulé est relargué au

lation de la traduction de l’ARNm p21 [12]. On a

niveau du cytoplasme pour être traduit suite au

Figure 3 Rôle potentiel des SG dans la régulation de l’expression de l’ARNm p21 Le traitement des cellules HeLa avec les inhibiteurs de protéasome pour 3-4 h induit la formation des SG, où l’ARNm p21 s’accumule. À cause de sa séquestration dans les SG, l’ARNm p21 n’est pas traduit. Le traitement prolongé (8-10 h) des cellules avec les inhibiteurs du protéasome induit une dépolymérisation des SG qui libèrent le pool accumulé de l’ARNm p21 qui sera massivement traduit en protéines. Vol.2 n°2

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NUMÉRO CRCQ

désassemblage des SG qui se produit pendant

position [27, 28]. Le séquençage à haut débit

un traitement prolongé (8 h) avec les inhibiteurs

de ces ARNm isolés a permis d’identifier ceux

de protéasome. Cette étude suggère donc que

présents dans ces granules et faisant donc po-

la séquestration des ARNm au niveau des SG

tentiellement partie des SG. Des études futures

inhibe leur traduction. Deux études récentes ont

devraient confirmer leur localisation dans les

pu reconstituer in vitro des granules à ARN res-

SG, mais surtout d’établir le rôle des SG dans la

semblant aux granules de stress par leur com-

répression de leur traduction.

Initiation de la traduction et formation des granules de stress Chez les cellules eucaryotes, la traduction

eIF4E est responsable de la reconnaissance

consiste en trois étapes : l’initiation, l’élonga-

des ARNm en se liant sur leur structure coiffe

tion et la terminaison. L’initiation de la traduction

(5’-m7GpppN). Pendant l’initiation de la traduc-

est un processus hautement régulé notamment

tion, eIF4G joue un rôle de protéine échafau-

durant la réponse au stress [29]. Cette étape

dage pour recruter le 43S à l’ARNm grâce à son

consiste en un assemblage successif d’une

interaction simultanée avec eIF3, lui-même lié

dizaine de facteurs d’initiation de la traduction

au 43S et à eIF4E complexé avec l’ARNm. Ceci

(eIFs) formant des complexes avec les sous-

conduit à la formation du complexe de pré-ini-

unités ribosomales et l’ARNm [30]. Cette étape

tiation 48S. Les facteurs eIF4F et eIF2α sont

débute par la formation du complexe tertiaire

alors relâchés et la sous-unité ribosomale 60S

eIF2.GTP.Met-tRNAiMet et son recrutement à la

est recrutée pour former le ribosome 80S qui

sous-unité ribosomale 40S, formant le complexe

est compétent pour démarrer la traduction. En

de pré-initiation 43S. L’étape suivante est l’asso-

condition de stress, l’initiation de la traduction

ciation du 43S à l’ARNm par le biais des facteurs

est régulée principalement par la phosphoryla-

eIF4F and eIF3. Le complexe eIF4F est compo-

tion du facteur eIF2α [29], événement égale-

sé de trois facteurs : le eIF4E, eIF4G et le eIF4A.

ment clé dans la formation des SG [8, 31].

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Mécanismes de formation des SG : lien fonctionnel avec l’inhibition de l’initiation de la traduction Formation des SG dépendante de la phosphorylation du facteur eIF2α La phosphorylation du facteur eIF2α est la pre-

ponse aux infections viraux [9, 17] alors que la

mière voie de signalisation démontrée comme

PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)

étant impliquée dans la formation des SG [8].

est responsable de la formation des SG en

La plupart des stress menant à la formation des

condition du stress du réticulum endoplasmique

SG sont connus comme étant des stress qui

[16]. La protéine general control non-derepres-

induisent la phosphorylation du facteur eIF2α

sible-2 (GCN2) est impliquée dans l’induction

au niveau de la serine 51 [11, 14]. Cette phos-

des SG en condition d’inhibition du protéasome

phorylation d’eIF2α empêche l’association du

dans les cellules embryonnaires fibroblastiques

facteur eIF2 avec le GTP et inhibe par consé-

de souris [33]. Enfin, la protéine heme-regula-

quent la formation du complexe tertiaire eIF2.

ted Inhibitor HRI semble être responsable de la

GTP.Met-tRNAiMet [29]. S’en suit une accumu-

formation des SG en condition d’arsenite [31].

lation de complexes d’initiation de la traduction

Nous avons également démontré le rôle majeur

déficients et incompétents pour la traduction;

de la protéine HRI dans la formation des SG

l’accumulation de ces complexes donnant lieu

en condition de traitement chimiothérapeutique

à l’assemblage des SG [19, 32]. La phospho-

des cellules cancéreuses, via la phosphoryla-

rylation d’eIF2α apparaît donc comme un évé-

tion d’eIF2α [11]. Les kinases de stress pour-

nement clé dans l’induction de la formation des

raient donc jouer un rôle non-soupçonné dans

SG en condition de stress. Cette modification

la chimiorésistance, en induisant la formation

de eIF2α est induite par quatre kinases de

des SG. Nos études en cours permettront de

stress dont le rôle dans la formation des SG est

déterminer si HRI pourrait être une cible théra-

aussi bien établi. La protéine kinase R (PKR)

peutique pour le traitement des cancers chimio-

est impliquée dans la formation des SG en ré-

résistants.

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Formation des SG dépendantes des autres facteurs d’initiation de la traduction Plusieurs inhibiteurs de l’initiation de la traduc-

formation des SG. Notre étude a confirmé que

tion furent récemment développés. Pateamine

l’inactivation des autres facteurs d’initiation de

A et Hippuristanol ciblent le facteur d’initiation

la traduction tels que eIF4B, eIF4H ainsi qu’eIF2

de la traduction eIF4A [34, 35], 4EG-I inactive

était suffisante pour induire la formation des SG.

le facteur eIF4E [36], tandis que MDMP bloque

Cependant, on a identifié dans ce travail [18]

l’association entre la sous-unité ribosomale 60S

deux étapes de l’initiation de la traduction, à sa-

avec la 40S [37]. Notre étude pionnière [17],

voir la formation du facteur eIF4F et celle du re-

appuyée par des études menées par plusieurs

crutement de la sous-unité ribosomale 60S, dont

laboratoires, a démontré que l’inactivation du

l’inhibition n’induit pas la formation des SG. Ceci

facteur eIF4A (soit par la Pateamine A ou par

démontre que les mécanismes de formation des

l’Hippuristanol) est suffisante pour induire la for-

SG et ceux régulant l’inhibition de l’initiation de la

mation des SG dans les cellules en culture sans

traduction peuvent être non couplés. L’initiation

pour autant induire la phosphorylation du fac-

de la traduction étant une cible privilégiée dans

teur eIF2α. Ces études démontrent donc l’exis-

le traitement du cancer [38-43] , notre étude a

tence de voies de formation alternatives des SG

ainsi révélé deux étapes clés de l’initiation de la

(autre que la voie de formation eIF2α-phospho-

traduction qui peuvent être ciblées sans induire

dépendante) et mettent en lumière le concept

la formation des SG et la résistance à la mort

selon lequel la formation des SG est intimement

cellulaire qui lui est associée. Nous poursuivons

liée à l’inhibition de l’initiation de la traduction.

nos études pour déterminer si l’inactivation de

La formation des SG ne dépendrait donc pas

la cible thérapeutique eIF4E ainsi que sa voie

exclusivement d’un apport de stress à la cellule.

régulatrice mTOR peut prévenir la formation des

Plus récemment, un criblage des facteurs

SG lors de traitements chimiothérapeutiques,

d’initiation de la traduction a été réalisé pour

sensibilisant ainsi les cellules cancéreuses ré-

déterminer ceux dont l’inactivation induisait la

sistantes à la mort cellulaire.

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NUMÉRO CRCQ

Rôle des SG dans la survie cellulaire Plusieurs études ont documenté le rôle des SG

SG dans la survie cellulaire : la séquestration

dans la résistance des cellules aux effets délé-

des molécules de signalisation de mort cellu-

tères du stress, induisant leur survie. Deux mo-

laire et la surexpression des facteurs de survie

dèles furent élaborés pour expliquer le rôle des

cellulaire.

Modèle de résistance par séquestration des molécules de signalisation : TRAF2 La protéine TRAF2 fait partie d’un complexe

la séquestration de TRAF2 au niveau des SG

TNFR1 composé du récepteur du TNFα, de la

(induites par le choc hyperthermique) rend le

protéine adaptatrice TRADD, et de la kinase

complexe TNFR1 inactif et donc incapable d’ac-

RIP1 [44]. L’activation de ce complexe est cru-

tiver les réactions pro-inflammatoires de mort

ciale pour transmettre les signaux menant à

cellulaire NF-kB. Ces travaux suggèrent un rôle

l’activation du facteur pro-inflammatoire NF-kB.

cyto-protecteur des SG lors du processus d’in-

L’étude de l’équipe de Jang [45] montre que

flammation menant à l’apoptose.

RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase1) La protéine RACK1 sert de protéine d’échafau-

gues génotoxiques de type Etoposide), RACK1

dage et d’activation pour plusieurs kinases telles

se localise dans les SG [47]. Cette séques-

que la protéine kinase C (PKC) et certaines ki-

tration de RACK1 au sein des SG prévient sa

nases (MTK1, MKK7) impliquées dans la voie

liaison avec la kinase MTK1 (faisant partie de

de signalisation JNK/MAPK. Elle joue un rôle

la voie apoptotique p38 et JNK-MAPK). Ceci

critique dans différents processus biologiques

inhibe l’activation de la voie MTK1-MAPK et

tels que la croissance, la migration et la différen-

subséquemment empêche l’entrée en apoptose

ciation cellulaire [46]. Lorsque la cellule subit un

de la cellule. Ces travaux ont donc établi que la

stress (c.-à-d. hypoxie, rayons ionisants, dro-

formation des SG peut interférer avec l’activa-

Vol.2 n°2

LAETITIA COUDERT ET COLL. 64

NUMÉRO CRCQ

tion des voies de signalisation de mort cellulaire

clés, permettant ainsi aux cellules de survivre

en séquestrant des molécules de signalisation

en cas de stress.

RSK2 (Serine/Thréonine p90 ribosomal S6 kinase 2) RSK2 est un facteur régulant différents aspects du

par le biais de TIA-1 au niveau des SG [49]. Ainsi

processus de prolifération et de survie cellulaire.

séquestré, RSK2 ne peut plus s’accumuler dans

Il modifie des protéines cibles telles que p27kip1,

le noyau et ne peut donc plus induire l’expression

TIF-1A [48] par phosphorylation. De plus, il relaie

de la cycline D1 ; un des facteurs clés régulant la

à l’intérieur des cellules certains signaux extracel-

phase G1 du cycle cellulaire. De plus, RSK2 (de

lulaires, notamment ceux induits par les facteurs

concert avec TIA-1) semble promouvoir la forma-

de croissance contrôlant la prolifération cellulaire.

tion des SG en condition des stress, permettant

En condition de stress oxydatif, RSK2 est recruté

ainsi à la cellule stressée de survivre.

Modèle de résistance par surexpression des facteurs de survie ARNm induit par l’hypoxie Il a été démontré que la radiothérapie des tu-

désassemblage des SG, relâchant le pool accu-

meurs induit la formation des SG suite aux

mulé des ARNm alors massivement traduits en

conditions hypoxiques crées par les radiations

cytokines telles que le VEGF. Ces dernières as-

[10]. Parallèlement à la formation des SG, l’état

surent la survie des cellules endothéliales per-

hypoxique des cellules active la transcription

mettant la vascularisation de la tumeur, lui assu-

spécifique d’ARNm codant pour des cytokines

rant une résistance aux radiations. Cette étude

de survie. Lors de la radiation de la tumeur, ces

établissant un lien entre la formation des SG et

ARNm sont recrutés au niveau des SG où ils

la radiorésistance des tumeurs nous amène à

sont protégés de la dégradation et où ils s’accu-

considérer ce « lien fonctionnel» comme une

mulent. Le mécanisme de reoxygénation des

potentielle cible thérapeutique pour le traite-

tumeurs qui fait suite à la radiation permet le

ment des cancers radio-résistants.

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LAETITIA COUDERT ET COLL. 65

NUMÉRO CRCQ

ARNm codant pour les protéines du cycle cellulaire La protéine p21 (Cyclin-dependent kinase inh-

impliquait la surexpression de la protéine p21

bitor) inhibe le cycle cellulaire en phase G1. De

facilitée par les SG [12]. Dans ces travaux, nous

ce fait, elle est impliquée dans la différenciation

avons d’abord montré qu’un traitement court

cellulaire et la sénescence et fut originellement

(4 h) des cellules cancéreuses au bortezomib

décrite comme inhibitrice de la progression tu-

(2uM) induisait la formation des SG, constituant

morale [50-52]. D’autres études ont cependant

la première démonstration que les drogues anti-

révélé un rôle anti-apoptotique de la protéine

cancéreuses peuvent conduire à la formation

p21 [53-55]. Il fut démontré que les conditions

des SG. La formation des SG, en condition de

de stress, incluant le traitement thérapeutique

bortezomib (2uM) est réversible, car les SG se

anti-cancer, induisaient une surexpression de

désassemblent suite à un traitement prolongé

la protéine. La surproduction de protéine p21

(> 8 h) avec cet agent chémothérapeutique.

inhibe ensuite l’activité de la machinerie apop-

De plus, la suppression des SG en éliminant le

totique, permettant la résistance des cellules à

facteur HRI sensibilise les cellules cancéreuses

la mort engendrée par le stress [53, 56]. Nous

chimiorésistantes au traitement bortezomib,

avons récemment identifié un mécanisme per-

suggérant un rôle important de la formation des

mettant la surexpression de la protéine p21 lors

SG dans cette chimiorésistance.

de traitement avec l’agent chimiothérapeutique bortezomib [12].

Notre étude subséquente a révélé un rôle majeur des SG dans la stabilisation et l’accumu-

Le bortezomib (de son nom clinique

lation de l’ARNm p21, induisant ainsi la surex-

Velcade) est un agent approuvé pour le trai-

pression de la protéine p21. Nos études d’hy-

tement des tumeurs liquides [57, 58], de type

bridation in situ ont montré que plus de 80 %

« inhibiteurs du protéasome ». Les tumeurs so-

de l’ARNm p21 produit s’accumulait dans les

lides sont résistantes au bortezomib [59, 60] et

SG. Cette accumulation dépend de la protéine

nous avons observé que cette chimiorésistance

CUGBP1 qui permet la stabilisation de l’ARNm

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LAETITIA COUDERT ET COLL. 66

NUMÉRO CRCQ

p21 dans les SG. Ce pool d’ARNm p21 ainsi ac-

non publiés) ont identifié d’autres ARNm dont

cumulé est relâché dans le cytoplasme après la

la surexpression en condition de bortezomib

dépolymérisation des SG où il va abondement

dépend des SG. L’étude du rôle des protéines

être converti en protéine. La surproduction de

codées par ces ARNm dans la chimiorésistance

p21 interfère avec la mort cellulaire, induisant

est en cours et pourrait aboutir à l’identification

ainsi une chimiorésistance. Notre travail a donc

de nouvelles cibles thérapeutiques. Il est très

révélé la protéine p21 comme cible thérapeu-

peu probable que ce mécanisme de chimioré-

tique pour le traitement de cancer résistant au

sistance, médié par les SG, soit spécifique au

bortezomib. Le développement de drogues qui

bortezomib. Des études sont en cours pour

empêcherait la formation des SG de façon spé-

identifier des agents chimiothérapeutiques in-

cifique serait aussi une approche prometteuse

duisant la formation des SG tout en permettant

pour le traitement de cancers résistants. En plus

aux cellules cancéreuses de survivre à ces trai-

de l’ARNm p21, nos données récentes (encore

tements.

Conclusion L’exposition des cellules au stress peut pertur-

être qualifié de pro-survie. De par cette capa-

ber le déroulement de processus intracellulaires

cité, les SG peuvent participer aux décisions «

essentiels. En effet, la formation des SG corrèle

de vie ou de mort » des cellules en détresse,

généralement avec une diminution globale de

en régulant de façon sélective l’activation des

la traduction et la répression ciblée d’ARNm

protéines de signalisation ainsi que l’expression

particuliers tels que ceux codant pour des fonc-

des ARNm impliqués dans la survie cellulaire et

tions du cycle cellulaire ou de la survie. Dans ce

l’apoptose. Ceci est particulièrement important

contexte particulier de stress, l’assemblage des

dans le cadre de la résistance des cellules can-

SG représente vraisemblablement un méca-

céreuses aux thérapies. Cependant, les événe-

nisme d’adaptation cellulaire important pouvant

ments moléculaires menant à leur assemblage/

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LAETITIA COUDERT ET COLL. 67

NUMÉRO CRCQ

désassemblage ne sont pas encore totalement

lopper des drogues pouvant cibler spécifique-

connus. Il serait donc primordial d’explorer ces

ment la formation des SG. L’utilisation de ces

mécanismes afin d’avoir une meilleure com-

suppresseurs des SG pourrait être combinée

préhension de la biogenèse des SG. Par cette

aux traitements conventionnels pour prévenir la

connaissance, nous serions capables de déve-

chimiorésistance.

Remerciements et Financements Cette revue est supportée par la subvention

rat au laboratoire de R. Mazroui. R. Mazroui est

Conseil de recherches en sciences naturelles et

récipiendaire de la bourse salariale Nouveaux

en génie du Canada (MOP-CG095386) de R.

chercheur IRSC.

Mazroui. L. Coudert est une étudiante au docto-

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REVUE

Les interactions de la corticostimuline (ACTH) avec son récepteur MC2 : Nouvelles connaissances et perspectives ACTH-MC2R interactions: overview, new findings and perspectives Nicole Gallo-Payet Service d’endocrinologie, Département de Médecine, Faculté de Médecine et des sciences de la santé Université de Sherbrooke et Centre de recherche clinique Étienne-Le Bel

Correspondance Nicole Gallo-Payet, PhD 3001, 12e avenue Nord, Sherbrooke, Québec, J1H 5N4 Canada 819 564-5243 [email protected]

Date de réception : 30 octobre 2012 Date d’acceptation : 11 janvier 2013 Vol.2 n°2

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Résumé En stimulant la synthèse des corticostéroïdes, l’hormone corticostimuline (ACTH) joue un rôle primordial dans l’homéostasie et la gestion du stress. Après une courte introduction sur les effets physiologiques et pathologiques engendrés par l’ACTH, la revue abordera les relations structure-fonction ACTH-récepteur MC2, ainsi que les voies de signalisation et la régulation fonctionnelle du R-MC2. Le développement de composés antagonistes compétitifs, qui lieraient le R-MC2 avec une grande sélectivité, mais sans induire d’activité biologique, serait très utile pour traiter les pathologies liées à des niveaux élevés d’ACTH (maladie de Cushing, sécrétion ectopique d’ACTH, hyperplasie congénitale des surrénales).

Summary By stimulating adrenal corticosteroid synthesis, the adrenocorticotropic hormone ACTH plays a pivotal role in homeostasis and stress response. In this review, we will discuss structure-activity relationships between ACTH and its receptor MC2, signaling pathways and regulation of the MC2R. Finally, we will discuss the opportunity to develop ACTH antagonists with high affinity for MC2R but unable to stimulate cAMP production. Such tools would be therapeutically useful for the treatment of conditions involving excess ACTH, such as Cushing’s disease, ectopic ACTH secretion or congenital adrenal hyperplasia.

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Introduction

L’

hormone corticostimuline (ACTH)

comportementales qui peuvent déboucher sur

joue un rôle majeur dans la physio-

diverses complications cardiométaboliques [4-7]

logie du cortex surrénalien en stimu-

(Figure 1). L’ACTH exerce son action en se liant

lant toutes les étapes conduisant à la produc-

à son récepteur MC2 (R-MC2) [2, 8] et en utilisant

tion des corticostéroïdes dans les trois zones du

l’AMPc comme second messager [9-13]. Cepen-

cortex. Les minéralocorticoïdes (principalement

dant, les mécanismes d’action de l’ACTH sont

l’aldostérone, produite par la zone glomérulée/

plus complexes que la simple relation ACTH-ré-

zona glomerulosa), jouent un rôle clé dans l’ho-

cepteur MC2-AMPc- corticostéroïdes [14].

méostasie hydrominérale, les glucocorticoïdes

Pathologies associées à une hypersé-

(dont le cortisol chez l’homme, produit par les

crétion d’ACTH - La maladie de Cushing (adé-

zones fasciculée et réticulée/zonae fascicu-

nome hypophysaire hypersécrétant d’ACTH) ou

lata et reticularis) jouent un rôle important dans

la sécrétion ectopique d’ACTH par une tumeur

l’homéostasie métabolique et les androgènes

extra-hypophysaire provoquent une stimulation

surrénaliens (dont la déhydroépiandrostérone

excessive du cortex surrénalien. L’augmentation

produite par la zone réticulée/zona reticularis),

chronique d’ACTH plasmatique entraîne une hy-

servent de précurseurs pour les androgènes et

perplasie bilatérale des glandes surrénales, avec

estrogènes circulants [1-3]. L’axe hypothalamo-

disparition des rythmes circadiens de l’ACTH et

hypophyso-surrénalien, par l’intermédiaire de

des glucocorticoïdes. Les traitements sont soit

l’ACTH et du cortisol est également bien connu

la résection sélective de l’adénome corticotrope

pour son rôle dans la gestion du stress. Cepen-

ou de la tumeur extra-hypophysaire, soit l’usage

dant, des augmentations soutenues d’ACTH et

de bloqueurs des voies de synthèse de la sté-

de cortisol conduisent notamment à des per-

roïdogenèse (metyrapone, mitotane ou ketoco-

turbations de leur cycle nycthéméral de sécré-

nazole). Cependant, ces composés ont des effi-

tion, s’accompagnant de plusieurs modifications

cacités parfois incomplètes et leur usage peut

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NICOLE GALLO-PAYET 74

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Stress

glucocorticoïdes

surpoids

Perte de Sommeil

Prise alimentaire

Figure 1. Implication des glandes surrénales dans plusieurs désordres métaboliques Dessin inspiré de Roberge et coll., 2007 [7].

s’accompagner d’effets secondaires [15]. Une Nicole Gallo-Payet-Revue MSA Interaction ACTH-récepteur ACTH

la corticolibérine (CRH) et de l’ACTH, menant

autre maladie liée à des hauts taux d’ACTH est

à une augmentation sélective de la production

l’hyperplasie congénitale des surrénales (HCS)

des androgènes surrénaliens [16]. Le traitement

(causée par un déficit enzymatique, principa-

par des glucocorticoïdes (GC) à dose physiolo-

lement de l’enzyme 21-hydroxylase, impliquée

gique n’arrive pas à supprimer l’excès d’ACTH

dans la synthèse du cortisol). Le déficit en corti-

et les taux d’androgènes restent donc élevés,

sol a pour conséquence une perte de rétroaction

ce qui a pour effet de viriliser les patientes avec

négative, ce qui provoque une augmentation de

HCS et d’accélérer la maturation osseuse de

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NICOLE GALLO-PAYET 75

NUMÉRO CRCQ

tous les patients, qui perdent ainsi 6 à 8 cm de

19]. Ainsi, dans ces trois exemples de patholo-

taille finale adulte [17]. D’un autre côté, l’usage

gies, développer un antagoniste dirigé contre le

de doses supraphysiologiques de GC peut

R-MC2 permettrait d’agir directement au niveau

réduire les taux d’ACTH, mais au prix d’effets

de la liaison de l’ACTH à son récepteur, sans

indésirables liés à l’hypercorticisme (hypergly-

entrer dans les multiples actions intracellulaires

cémie, hypertension artérielle, ostéoporose

induites par l’activation du complexe hormone-

et croissance réduite). D’autres pathologies,

récepteur. Ceci souligne le grand intérêt d’une

comme l’hyperaldostéronisme primaire, sont

étude détaillée des interactions de l’ACTH avec

associées à une surexpression du R-MC2 [18,

son récepteur MC2.

Les relations structure-fonction – ACTH-R-MC2 Après la découverte de l’AMPcyclique comme

que s’accumuler. Ce n’est qu’avec le clonage

second messager de l’ACTH en 1958 [20], les

du récepteur en 1992 [8], suivi du clonage de la

premières études de liaison hormone-récepteur

protéine d’échafaudage, Melanocortin 2 Recep-

ont été réalisées en 1970 par Robert Lefkowitz

tor Accessory Protein (MRAP) en 2005 [22], que

(prix Nobel de chimie 2012) [21]. Malgré ces

quelques-unes des particularités de R-MC2 ont

débuts prometteurs, les embûches n’ont fait

été élucidées.

L’ACTH : une partenaire exigeante L’ACTH fait partie de la grande famille des pep-

dorphines et les mélanocortines. La POMC est

tides issus du précurseur pro-opio-mélanocor-

exprimée au niveau des lobes antérieur et inter-

tine (POMC) identifié en 1979 par les groupes

médiaire de l’hypophyse, de plusieurs régions

de Michel Chrétien [23] et Nakanishi [24]. Suite

du cerveau et plusieurs tissus périphériques

à des clivages par des enzymes convertases

[25, 26]. L’ACTH correspond aux acides ami-

spécifiques, la POMC va générer trois familles

nés (a.a.) 138-176 de la POMC [26] , et peut

de peptides : les fragments N-terminaux, les en-

être clivée par la convertase PC2 pour donner

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NICOLE GALLO-PAYET 76

NUMÉRO CRCQ

l’αMSH (a.a. 1-13 de l’ACTH) [26] (Figure 2).

(@ 10%), alors que la production d’AMPc né-

Les travaux de structure-fonction effectués

cessiterait une plus grande occupation des sites

dans les années 1970-1980 ont permis l’identifi-

(« a single site-receptor model ») [30, 33]. Le

cation des a.a. de la molécule d’ACTH qui sont

troisième concept implique que la région 15-24

essentiels à la production de l’AMPc et ceux

serait critique pour la liaison de l’ACTH à son

essentiels à la liaison à son récepteur [27, 28].

récepteur, ce qui expliquerait pourquoi l’a-MSH

Ces études ont montré que certains fragments

(a.a. 1-13) n’a pas d’effet sur les cellules cortico-

de l’ACTH étaient non seulement inactifs d’un

surrénaliennes. Deux informations se dégagent

point de vue biologique, mais agissaient comme

de ces études. Une première séquence, appe-

antagonistes des effets de l’ACTH, notamment

lée « message », essentielle pour la production

le fragment 7-38 de l’ACTH(1-39) appelé Cor-

d’AMPc, correspond aux a.a, 6 à 9 de l’ACTH et

ticotropin-Inhibiting Peptide (CIP) [29-32] (pour

de l’a-MSH (séquence HFRW ; His6-Phe7-Arg8-

revue, voir [27]). De ces études sont nés trois

Trp9). Une seconde séquence (KKRR (Lys15-

grands concepts. L’un d’eux, issu des études

Lys16-Arg17-Arg18) serait la séquence minimale

action-dose,

fragments

essentielle à la liaison de l’ACTH à son récep-

ACTH(1-10) et ACTH(11-24) utilisaient deux

teur. Elle a été appelée « adresse » (Figure 2).

sites récepteurs distincts, l’un utilisant l’AMPc

Ainsi, ces deux séquences sont nécessaires à

comme second messager, l’autre possiblement

la réponse à l’ACTH en permettant d’une part la

le calcium. Ces deux voies de signalisation se-

reconnaissance et la liaison au récepteur, puis

raient complémentaires pour induire la pleine

d’autre part son activation et la production intra-

réponse corticotrope (« dual receptor model»).

cellulaire d’AMPc.

suggérait

que

les

Le second concept est basé sur la notion de ré-

Après les premières études de Lefkowitz

cepteurs de réserve. La stimulation de sécrétion

et coll. [21], la synthèse de l’analogue Phe2,

de corticostérone ne nécessiterait que l’occupa-

Nle4-ACTH(1-39), iodé sur la résidu tyrosine 23

tion d’une faible proportion des sites récepteurs

a permis d’obtenir une hormone marquée qui

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NUMÉRO CRCQ

Figure 2

A

Proopiomélanocortine (POMC) (1-241) PC1/2

N-POMC (Pro-J-MSH)

(1-39)

PC1/2

N-POMC1-52

PC1/2

ACTH

E-lipotropine (LPH) (42-134)

PC2

PC2

Joint Peptide

J-LPH D-MSH (1-13)

PC2

CLIP

EE-endorphine

PC2

N-POMC1-49 E-MSH

J-MSH

B

Suffisants pour lier et stimuler MC1R, MC3R, MC4R et MC5R

Met-Enkephaline

Sélectivité du MC2R

SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYP 1

6 7 8 9

11 13

15 16 17 18

24

Peptide avec activité antagoniste

Figure 2. Formation et propriétés de l’hormone corticotropine (ACTH) A Le précurseur pro-opio-mélanocortine (POMC) subit des clivages par des enzymes qui génèrent trois familles de peptides actifs, les fragments N-terminaux, les endorphines et les mélanocortines. CLIP, Corticotrin-like intermediate peptide. B Les études de structure-fonction ont permis l’identification des acides aminés essentiels à la production de l’AMPc et ceux essentiels à la liaison de l’ACTH à son récepteur MC2. Par ailleurs, ces études ont permis d’identifier un fragment se comportant comme un antagoniste compétitif de l’ACTH. Adapté de Dores et coll., 2009 (A) [7] et de Irani et coll., 2004 [82] (B).

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NICOLE GALLO-PAYET 78

NUMÉRO CRCQ

conservait son activité biologique, puisque

cité, et un autre de plus faible affinité (Kd = 10

celle-ci implique la tyrosine en position 2,

nM), mais de forte capacité [35-37]. L’iden-

laissée intacte dans cette formulation [34].

tité et le rôle exact de ces sites demeurent

Avec un tel peptide iodé, plusieurs études ont

toujours controversés [10, 12, 14, 38]. Les

mis en évidence la présence de deux sites

hypothèses des deux sites émises par divers

de liaison - un de haute affinité (constante de

groupes [30, 33, 39-41] sont donc toujours

dissociation Kd = 10 pM), mais de faible capa-

d’actualité [42].

Signalisation intracellulaire de l’ACTH - pas si simple que cela Une des grandes énigmes de la signalisation de

co-surrénaliennes sont caractérisées par un po-

l’ACTH est le décalage entre la concentration

tentiel de repos négatif (variant de -40 à -70 mV

de demi-effet maximal (EC50) pour la stimulation

selon les études). L’application d’ACTH induit

de la stéroïdogénèse (entre 10 et 50 pmol/l) et

une dépolarisation de la membrane créée par

celle pour la production de l’AMPc est (voisin de

l’inhibition de canaux potassiques [48, 49], mais

1 nmol/l) [39], ce qui indique que l’ACTH utilise

aussi la phosphorylation PKA-dépendante des

d’autres médiateurs intracellulaires que l’AMPc.

canaux calciques voltage-dépendants de type

En fait, une stimulation de la stéroïdogénèse

L (cellules glomérulées) [50, 51] ou une action

par l’ACTH peut être observée dans des condi-

sur des canaux de type T (cellules fasciculées)

tions où aucune production d’AMPc n’est détec-

[52, 53] et/ou de canaux chlore [54, 55]. Plus

table [40]. Le calcium semble être ce premier

récemment, des études ont montré que l’ACTH

« second messager » [40, 43-46]. Ce dernier

induisait également la synthèse de ces canaux

intervient dans l’activation d’au moins trois pro-

calciques et potassiques [56, 57]. Au total, la ré-

téines clés de la stéroïdogénèse, soit StAR,

ponse soutenue et intense de l’ACTH s’explique

cytochrome P450scc et 3b-HSD [47]. Comme

par la mise en jeu de plusieurs isoformes d’ade-

plusieurs cellules excitables, les cellules corti-

nylyl cyclases [58], l’inhibition transitoire de la

Vol.2 n°2

NICOLE GALLO-PAYET 79

NUMÉRO CRCQ

phosphodiestérase PDE2, l’intervention des

pase A2 et la production d’inositols phosphates

sous-unités βg des protéines Gi, la production

[14] (Figure 3).

de GMPc ainsi que l’activation de la phospholi-

ACTH

AC 5 5/6 Ds

AC 3 Ca2+

AC 2/4 EJJ E

P

EJJ E PLC PLA2

ATP GMPc

InsPs DAG

AMP cAMP

KA A PKA

Ca2+ C

PDE2

AMP Aldostérone Cortisol Androgènes

Figure 3. Principales voies de signalisation mises en jeu par l’action de l’ACTH sur les cellules corticosurrénaliennes L’ACTH induit une production d’AMPc via la protéine Gs et l’activation séquentielle de plusieurs adenylyl cyclases, celles insensibles au Ca2+ (AC5/6), sensibles au Ca2+ (AC1/3) et celles activées par les sous-unités g des protéines G. L’AMPc généré active la protéine kinase A qui phosphoryle les canaux calciques de type L et permet un influx de Ca2+. Parallèlement, la production de GMPc entraîne une inhibition de l’activité de la phosphodiestérase PDE2. Ces actions combinées expliquent l’accumulation importante d’AMPc. D’autres voies sont mobilisées, comme les voies des phospholipases A2 et C. Adapté de Gallo-Payet et coll. 2001 [52] et de GalloPayet et Payet, 2003 [14]. Vol.2 n°2

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NUMÉRO CRCQ

Les propriétés moléculaires du R-ACTH, MC2 Clonage des récepteurs aux mélanocortines Cinq récepteurs sont actuellement répertoriés.

d’homologie avec les autres RCPGs de classe A

Le récepteur MC1 de l’a-MSH a été cloné en

et leurs structures primaires sont parmi les plus

1992 par les groupes de Jarl Wikberg [59] et

petites des RCPGs, variant de 297 à 360 aa

Roger Cone [60], lequel a cloné simultanément

comparativement à 413 a.a. pour le β2AR. Le

le récepteur MC2 de l’ACTH [8]. Malgré leur

gène codant pour le R-MC2 humain ne présente

structure voisine, les récepteurs des mélano-

que 40% d’homologie avec les récepteurs MC1,

cortines déclenchent des effets spécifiques et

MC3, MC4 et MC5 [13, 28, 60]. Le R-MC2R est

diversifiés. Bien qu’ils appartiennent à la classe

surtout exprimé au niveau des glandes surré-

A et à la sous-classe A12 des RCPGs, les R-

nales [2, 12, 61], mais aussi au niveau des adi-

MCs présentent plusieurs caractéristiques qui

pocytes où il contrôle la lipolyse [62]. L’ACTH

les distinguent des autres RCPG, d’où la créa-

(1-39) et l’a-MSH activent de façon égale les

tion d’une nouvelle famille, les récepteurs aux

R-MC1, MC3, MC4 et MC5, mais le R-MC2 ne

mélanocortines. Ils ne possèdent que 40-60%

peut être activé que par l’ACTH [8, 63].

Propriétés du récepteur MC2 Toutes les informations et prédictions des an-

pétitifs, ne déplaçant toutefois que 60 à 70%

nées 70 [31-33, 64, 65] ont été validées grâce

de la liaison du traceur [41]. Les études plus

à des expressions hétérologues des MC1R

récentes, utilisant les méthodologies de substi-

et MC2R [41, 63]. En particulier, les peptides

tution (alanin-scan) et mutagenèse dirigée ont

ACTH(1-24), (1-39) et (1-17) présentent des

confirmé que la séquence KKRR était impor-

propriétés agonistes, alors que les peptides

tante pour la liaison ACTH-R-MC2 (construc-

ACTH(11-24) [32] et ACTH(7-38) (CIP) [29]

tion K15A et R17A inactives), mais aussi que

se comportent comme des antagonistes com-

le remplacement des a.a.15 et 18 par une

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glutamine (K15Q, R17Q) étaient capables de

donc de la sélectivité de liaison ACTH-R-MC2

restaurer l’activité du complexe ACTH-R-MC2

[68]. Cependant, aucune étude de modélisation

[66]. Des études de constructions chimériques

et de cristallographie n’a encore été publiée

entre R-MC2 et R-MC4 [42, 67, 68] ont mis en

pour confirmer ou infirmer l’hypothèse selon

évidence que le 1er segment transmembranaire

laquelle la liaison de la séquence « adresse »

du R-MC2 est important pour l’expression

KKRR de l’ACTH entraîne un changement de

membranaire du récepteur et que les 2e et 3e

conformation du récepteur, qui permet à la sé-

segments transmembranaires sont importants

quence « message » HFRW de l’ACTH de se

pour la signalisation MRAP-dépendante et

lier au récepteur.

Régulation fonctionnelle du récepteur MC2 Contrairement à la plupart des voies de signa-

transfectée dans les cellules HEK était retenue

lisation des RCPGs, l’ACTH induit une aug-

dans un compartiment intracellulaire [70-72].

mentation du nombre de récepteurs MC2 et,

Les auteurs en ont déduit que l’expression fonc-

à plus long terme, une augmentation de son

tionnelle du R-MC2 nécessitait soit des cellules

expression [37, 69]. La recherche dans le do-

d’origine surrénalienne, soit la coexpression

maine de la régulation fonctionnelle du R-MC2

d’un autre MCR ou d’une protéine chaperone.

a été sérieusement freinée par le manque de

En 2005, l’équipe de Adrian J Clark a identifié

système d’expression hétérologue approprié.

la protéine MRAP, essentielle à l’expression

Les tentatives pour exprimer le R-MC2 dans

fonctionnelle du R-MC2 [22, 73]. Le travail de

les lignées cellulaires utilisées couramment

l’équipe Clark a conclu que MRAP était le fac-

pour les RCPGs dits « classiques » ont toutes

teur responsable de l’adressage à la membrane

échoué [10, 12]. Les premières études avaient

et donc de l’expression fonctionnelle du MC2R

utilisé l’ADNc du R-MC2 étiqueté avec la GFP

[22]. Dans notre laboratoire, nous avons adopté

(green fluorescent protein). Cette construction

la stratégie de couplage de l’ADNc du R-MC2

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humain (R-hMC2) avec l’épitope c-Myc en N-

impliquées dans la désensibilisation du R-MC2.

terminal. Nos premières études réalisées avec

Cependant, seule la PKA est impliquée dans

les cellules HEK293 montraient que le récep-

l’internalisation du récepteur, puisqu’une préin-

teur Myc-hMC2 était exprimé à la membrane

cubation avec du H89 bloque ce phénomène,

plasmique alors que le récepteur GFP-hMC2

alors que le GF109203X est sans effet [74].

était retenu dans des compartiments intracellu-

Pour étudier de façon précise la régu-

laires. Ces résultats indiquent que la petite taille

lation fonctionnelle du récepteur, nous avons

du MC2R (297 a.a.) ne permet pas l’utilisation de

développé un modèle de lignées cellulaires iso-

GFP comme protéine d’étiquetage. Par contre,

géniques (HEK293/FRT) exprimant le R-hMC2,

ce récepteur n’était pas fonctionnel en termes

ainsi que les isoformes humaines, MRAPa et

de production d’AMPc [74]. En revanche, dans

MRAPb, que nous avons clonées à partir de

des cellules M3 (lignée de mélanome de sou-

surrénales fœtales humaines [72]. Le R-hMC2

ris), le R-Myc-hMC2 est exprimé à la membrane

s’exprime à la membrane en absence des

plasmique, est fonctionnel (production d’AMPc)

MRAPs, mais celles-ci sont indispensables à

et présente la même puissance que le récepteur

la production d’AMPc induite par l’ACTH. Les

endogène du cortex surrénalien. Les études de

résultats montrent aussi que les MRAPs mo-

régulation fonctionnelle ont montré qu’une sti-

dulent différemment la sensibilité et la produc-

mulation soutenue avec l’ACTH s’accompagne

tion maximale d’AMPc [72]Plusieurs travaux ont

d’abord d’une désensibilisation, suivie d’une

documenté les propriétés structurales et fonc-

internalisation durant les 30 premières minutes

tionnelles des MRAPs [75-78]. En générant des

de stimulation, puis d’un recyclage partiel à la

mutants correspondant à chacune des régions

membrane. La préincubation des cellules avec

de MRAPa et MRAPb, nous avons observé

les inhibiteurs de protéine kinase A (H89) ou de

que la région N-terminale seule est peu expri-

protéine kinase C (GF109203X) annule cette

mée à la membrane par rapport à la molécule

désensibilisation, indiquant que ces kinases sont

complète, que la portion conservée est suffi-

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sante à induire une expression fonctionnelle

et d’internalisation de ces mutants ont permis

du R-MC2 et que les portions divergentes sont

d’identifier des a.a. importants pour l’expression

impliquées dans une modulation spécifique de

et la régulation fonctionnelle de MC2R. Ainsi, la

l’affinité et de la réponse maximale à l’ACTH

mutation T143A indique qu’un seul acide aminé

[79]. En utilisant ce modèle, nous avons éga-

peut bloquer l’adressage membranaire et donc

lement montré une co-internalisation de hMC2

la fonction du récepteur. Contrairement au ré-

et des isoformes MRAPa et β. De la population

cepteur natif, l’adressage à la membrane plas-

des récepteurs internalisés, environ un tiers est

mique des mutants T143S et T143D semble dé-

recyclé vers la membrane plasmique et une

pendre presque exclusivement de l’expression

certaine proportion est aussi dégradée [80]

de MRAPa/β. Par ailleurs, les mutants T131A,

(Figure 4). Pour déterminer les sites du R-MC2

T131D, S140D et S280D sont résistants à l’in-

importants pour sa fonctionnalité, nous avons

ternalisation induite par l’ACTH et sont forte-

généré des récepteurs mutés pour tous les

ment exprimés à la membrane plasmique [80].

résidus Ser et Thr intracellulaires des boucles

Ces travaux indiquent que la boucle i2 est cru-

i2, i3 et portion C-terminale [80]. Les analyses

ciale pour l’expression de R-MC2 et sa régula-

d’expression de surface, de production d’AMPc

tion fonctionnelle [80] (Figure 5).

Faire du neuf avec du vieux – Retour sur le passé Grâce au travail concerté de plusieurs cher-

HFRW, essentielle à l’activité fonctionnelle. Des

cheurs [81], nous avons établi les causes d’une

peptides mutants ont été synthétisés et nous

déficience en glucocorticoïdes causée par une

avons comparé leurs propriétés avec celles des

ACTH inactive, mais immunoréactive. Nous

formes natives d’ACTH (liaison au R-MC2) ou

avons montré que la déficience était due à une

NDP-MSH (liaison aux R-MC4 et R-MC1) pour

mutation du gène de la POMC (p.R145C). Cet

leur capacité à lier leurs récepteurs respectifs et

a.a. (ACTH p.R8C) est situé dans la séquence

à stimuler la production d’AMPc. Nos résultats

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ACTH MRAPD MRAPE

MC 2

Plasma membrane

P

Rab4 Recyclage rapide

Rab5 Rab11 Recyclage lent

Rab7 Dégradation lysosomale minime

Figure 4. Schéma de la régulation fonctionnelle du récepteur de l’ACTH (R-MC2) Après l’exposition à de fortes doses d’ACTH (100 nM), le complexe ACTH/R-MC2/MRAPα/β est internalisé. Une proportion de ces récepteurs est recyclée vers la membrane plasmique, soit de façon rapide, via les endosomes associés à Rab4, soit de façon lente via les endosomes associés à Rab5 et Rab11. Une certaine proportion est aussi dégradée via les endosomes associés à Rab7. Les études ont été réalisées dans des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur ACTH humain (hMC2R) et ses protéines partenaires, les Melanocortin 2 Receptor Accessory Protein (MRAPa et MRAPβ). Dessin inspiré de Roy et coll. 2011 [80] et Roy et coll. 2012 [84].

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MC2R

N-ter.

147 131 143

C-ter.

Figure 5. Mise en évidence d’acides aminés essentiels à la liaison de l’ACTH à son récepteur MC2 et à sa fonctionnalit A Les acides aminés Ser/Thr importants pour l’expression et la fonctionnalité du récepteur MC2 sont localisés dans la seconde boucle intracellulaire. B Mesure d’expression de surface et de production d’AMPc dans des cellules HEK293 exprimant de façon stable MRAPb et divers mutants du R-MC2 humain. Un scan Ala/Asp (A/D) de tous les Ser/Thr (S/T) intracellulaires a été réalisé. Les mutations T147D et T143A abolissent l’expression de surface et la fonctionnalité de hMC2. Par contre, les mutations T131A et T131D empêchent l’internalisation de MC2R et produisent ainsi une stimulation en AMPc semblable à celle obtenue avec le récepteur sauvage. Adapté de Roy et coll. Mol Endocrinol., 2011 [80]. Vol.2 n°2

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NUMÉRO CRCQ

indiquent que le peptide ACTH muté (ACTH-

pétitifs. De tels outils seraient très utiles pour

R8C) non seulement ne stimule pas la produc-

traiter les pathologies liées à des excès d’ACTH

tion d’AMPc, mais ne se lie pas non plus au

circulante (maladie de Cushing, sécrétion ecto-

R-MC2, alors que les études antérieures attri-

pique d’ACTH et syndrome d’HCS) ou à une

buaient à la séquence HFRW le rôle de « mes-

expression augmentée du R-MC2 (hyperal-

sage », mais que la région « adresse » était

dostéronisme primaire). Dans les deux cas, les

située plus en aval (KKRR; a.a. 15-18). Nos

traitements disponibles actuellement contreba-

études effectuées sur des modèles complète-

lancent à peine les effets secondaires engen-

ment humains remettent donc en question les

drés sur le métabolisme général [15]. Les outils

résultats classiques de structure-fonction, obte-

actuels et les nouvelles méthodes d’exploration

nus jusqu’alors chez des modèles murins ou

et d’exploitation devraient permettre le dévelop-

bovins.

pement de tels composés, liant le R-MC2 avec

Notre modèle pourrait être utilisé pour développer des composés antagonistes com-

une haute affinité tout en inhibant la réponse biologique induite par l’ACTH.

Remerciements et financements Je tiens à exprimer mes remerciements à tous les

Pinard, ainsi que mes collègues Marcel D Payet

étudiants, étudiantes et stagiaires postdoctoraux

et Johnny Deladöey pour la lecture et critiques

qui ont participé aux études sur les mécanismes

bienveillantes, ainsi que pour leur précieuse

d’action de l’ACTH et les propriétés fonctionnelles

collaboration. Les travaux effectués sur l’ACTH

du R-MC2. Par ordre d’ancienneté : Thierry

sont financés par les Instituts de Recherche en

Durroux, Eric Tremblay, Mylène Côté, Alzbeta

Santé du Canada et par la Chaire de recherche

Chorvatova, Zuzana Kilianova, Simon Roy et

du Canada en Endocrinologie de la Glande

Sandra Pinard. Je remercie Lucie Chouinard,

surrénale.

Lyne Bilodeau, Marie-Odile Guimond et Sandra Vol.2 n°2

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NICOLE GALLO-PAYET 91

NUMÉRO CRCQ

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REVUE

L’immunothérapie pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique Immunization approaches for the treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis Audrey Labarre, Bastien Paré, Lydia Touzel-Deschènes et François Gros-Louis Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale (LOEX) Centre de recherche du CHU de Québec

Correspondance François Gros-Louis Hôpital de l’Enfant-Jésus (Bureau R-211) 1401, 18e rue Québec, Québec, G1J 1Z4 Canada 418 990-8255 poste 1708 [email protected]

Date de réception : 31 octobre 2012 Date d’acceptation : 5 avril 2013

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Résumé La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie encore incurable caractérisée par la dégénérescence sélective des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière. Des mutations dans le gène SOD1 sont l’une des principales causes génétiques connues associées à la SLA familiale. La découverte d’un mécanisme pathogénique basé sur la sécrétion de la SOD1 mutante a mené au développement de différentes stratégies d’immunisation afin de réduire les niveaux de la SOD1 mutante dans le système nerveux. Les protocoles d’immunisation développés ont tous mené au prolongement de la survie des souris transgéniques exprimant la SOD1 mutante. Le développement d’une immunothérapie efficace et sans danger pour le patient pourrait donc devenir une approche envisageable pour le traitement de la SLA.

Summary Amyotrophic lateral sclerosis (SLA) is an adult-onset neurodegenerative disease characterized by loss of motor neurons in the brain and spinal cord. Mutations in the SOD1 gene are amongst the major known genetic causes associated with familial ALS. The discovery of a secretion pathway for mutant SOD1 increased the possibility of using immunization approaches to reduce the burden of toxic SOD1 species in the nervous system. Both active and passive immunization protocols were successful in delaying the onset of disease and prolonging survival in immunized transgenic mice expressing mutant SOD1. Harnessing the immune system through immunization approaches might offer therefore promising future therapeutic avenues.

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NUMÉRO CRCQ

Introduction

L

a Sclérose Latérale Amyotrophique

gène SOD1 trouvées chez les patients SLAF,

(SLA) est une maladie caractérisée par

ont déjà été générés (tableau 1). Dans tous ces

la dégénérescence sélective des neu-

modèles de souris, on observe la mort massive

rones moteurs du cerveau et de la moelle épi-

des neurones moteurs de la moelle épinière et la

nière. Elle se déclenche généralement à l’âge

perte d’axones myélinisés dans les racines ven-

adulte, entraînant une paralysie progressive et

trales motrices menant à des déficits moteurs,

la mort dans les 3 à 5 ans suivant l’apparition

de l’atrophie musculaire et à une paralysie fa-

des premiers symptômes. Environ 10% des cas

tale. En plus de la dégénérescence neuronale

de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont spo-

observée chez ces modèles murins, on observe

radiques (SLAS) [1]. À l’heure actuelle, des mu-

également, de façon similaire à la pathologie

tations dans les gènes SOD1, TARDBP, FUS/

humaine, une astrocytose et une microgliose

TLS et C9ORF72 sont les principales causes

dans les tissus lésés. En dépit de ces similitudes

clairement identifiées de la SLAF [2-6]. Toute-

histopathologiques, le moment d’apparition des

fois, pour la plupart des cas de SLA, c.-à-d. les

premiers symptômes, la progression et la sévé-

cas sporadiques, les causes demeurent tou-

rité de la maladie diffèrent souvent de façon

jours inconnues. De façon intéressante, il a été

drastique. À ce jour, les chercheurs n’ont pas

démontré que les cas sporadiques partageraient

encore été en mesure d’établir une corrélation

avec les cas familiaux une voie pathogénique

entre ces différences phénotypiques et l’activité

commune impliquant le mauvais repliement de

enzymatique de SOD1, pouvant varier selon la

la protéine SOD1 [7]. Plus de 150 différentes

nature de la mutation, ou encore avec la sta-

mutations faux-sens dans le gène SOD1 ont été

bilité des différentes protéines SOD1 mutantes.

identifiées.

SOD1 est une importante métalloprotéine res-

Plusieurs modèles de souris transgé-

ponsable en quelque sorte de la défense contre

niques, surexprimant des mutations dans le

le stress oxydatif et la production de radicaux

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Lignée Publication originale Promoteur Expression du transgène Dégénération neurone moteur Stabilité de la protéine Début des symptômes Progression de la maladie Accumulation SOD1 mal repliée

G93Ahigh

G93Alow

G37R

G85R

hWT-SOD1

Sod1 KO

Gurney et al., Science 1994

Alexander et al., Brain Res Mol Brain Res 2004

Wong et al., Neuron 1995

Bruijn et al., Neuron 1997

Bruijn et al., Science 1998

Reaume et al., Nat Genet. 1996

hSOD1 Élevée Ubiquitaire

hSOD1 Faible Ubiquitaire

hSOD1 Faible Ubiquitaire

hSOD1 Faible Ubiquitaire

hSOD1

---

Élevée Ubiquitaire

---

Oui

Oui

Oui

Oui

Non

Non

Stable

Stable

Stable

Réduite

Stable

---

Tôt 3-4 mois Modérée (3 semaines)

Tardif 6-7 mois Lente (8 à 9 semaines)

Tardif 11 mois Lente (4 à 6 semaines)

Tardif 7,5 mois Rapide (2 semaines)

---

---

---

---

Élevée

Élevée

Modérée

Modérée

Aucune

Aucune

--- : ne s’applique pas

Tableau 1. Souris transgénique SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLA

libres lors de la respiration cellulaire. La grande

plutôt que d’une perte de fonction. De plus, les

variabilité dans l’activité enzymatique associée

souris transgéniques surexprimant de façon

aux différents mutants SOD1 et l’absence de

ubiquitaire diverses mutations du gène SOD1

dysfonctionnement moteur ou autres signes de

humain développent une neurodégénéres-

dégénération chez des souris knock-out (KO)

cence qui est similaire à la maladie humaine

pour le gène Sod1, rend la perte de la fonction

[10-13]. Toutefois, des souris transgéniques

un mécanisme pathogénique peu probable [8,

surexprimant à un niveau similaire la protéine

9]. Ces résultats suggèrent donc que la toxicité

SOD1 humaine de type sauvage (tgSOD1wt) ne

des divers mutants SOD1 viendrait d’un gain

développent pas la maladie [14]. Bien que ces

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AUDREY LABARRE ET COLL. 96

NUMÉRO CRCQ

modèles impliquent la protéine SOD1 mutante

avec le gain de propriétés toxiques associé

dans le développement de la dégénérescence

aux mutations du gène SOD1, suggérant que

des motoneurones, le mécanisme par lequel

l’adoption d’une mauvaise conformation pour-

SOD1 mutante provoque une dégénérescence

rait induire une forme de toxicité associée à la

spécifique des motoneurones, en l’absence de

protéine SOD1 ainsi modifiée. Plusieurs effets

pathologie dans d’autres tissus ou organes,

délétères peuvent résulter de l’interaction de

reste encore mal compris. Étonnamment, les

la protéine SOD1 mal repliée avec des com-

souris transgéniques exprimant de façon spéci-

posants cellulaires essentiels (figure 1). Des

fique la SOD1 mutante seulement dans les neu-

études ont démontré qu’une fraction de SOD1

rones (NFL-SOD1G37R) ne développent pas

mutante pouvait être transférée via le réseau

la maladie [15]. De plus, des études avec des

réticulum endoplasmique (RE)-Golgi. De plus,

souris SOD1 mutantes chimériques démontrent

les chromogranines, protéines abondantes

que la toxicité de la SOD1 mutante n’est pas

dans les neurones moteurs, les interneurones

uniquement intrinsèque aux motoneurones [16].

et les astrocytes activés, pourraient agir en tant

Diverses hypothèses ont été proposées

que protéines chaperonnes afin de promouvoir

comme contributeurs potentiels de la mala-

la sécrétion de SOD1 mal repliée [17, 18]. La

die, telles que les dommages oxydatifs, l’exci-

protéine SOD1 mutante extracellulaire pour-

totoxicité, les anomalies mitochondriales, la

rait alors induire une microgliose et la mort des

neuroinflammation et l’autophagie, mais ces

motoneurones [18]. Un tel mécanisme patho-

derniers pourraient être secondaires au pro-

génique, basé sur la toxicité de SOD1 mutante

cessus de neurodégénérescence. L’hypothèse

sécrétée, est en lien avec les conclusions selon

la plus vraisemblable à ce jour est que la toxi-

lesquelles la maladie n’est pas strictement in-

cité de la protéine SOD1 mutante serait liée à

trinsèque aux neurones moteurs et que la toxi-

un mauvais repliement tertiaire de la protéine

cité se propage d’une cellule à une autre [16,

[7]. Cette hypothèse est pleinement compatible

19, 20]. Toutefois, même si un tel modèle est

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NUMÉRO CRCQ

Figure 1. Modèle de toxicité associé au mauvais repliement de la protéine SOD1 et à son agrégation Dans des conditions normales, le monomère réduit (non métallé) de SOD1 se dimérise avec lui-même avant que les ions métalliques du cuivre (Cu) et de zinc (Zn) puissent s’incorporer au dimère. La formation de ponts disulfures intramoléculaires permet ensuite la stabilisation de l’enzyme. Le mauvais repliement de la protéine SOD1 par divers facteurs qui favorisent la conversion des monomères réduits vers sa forme mal repliée mène à la formation de petits et de gros agrégats protéiques avec des propriétés toxiques.

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NUMÉRO CRCQ

intéressant et suggère que SOD1 mal repliée

murins transgéniques ont démontré que la ré-

peut induire le mauvais repliement de SOD1WT

ponse immunitaire pourrait jouer un rôle impor-

(protéine sauvage), la vulnérabilité sélective des

tant dans le processus de dégénération [21-24].

neurones moteurs dans la SLA reste énigma-

Le système immunitaire pourrait avoir des effets

tique. Les défis dans l’avenir sont donc d’iden-

bénéfiques ou indésirables selon le contexte.

tifier quels sont les dommages somatiques pro-

Récemment, des approches expérimentales

voquant un changement de conformation de la

visant à induire une réponse immunitaire humo-

protéine SOD1, de découvrir des façons de pré-

rale chez les modèles murins de SLA ont connu

venir le mauvais repliement de cette protéine et

des effets bénéfiques. Dans cet article, nous

de limiter sa propagation à travers le système

ferons une revue et discuterons de la manière

nerveux.

dont l’activation du système immunitaire via des

Bien que la SLA ne soit pas considérée

approches d’immunisation pourrait offrir des

comme une maladie déclenchée par le système

avenues thérapeutiques prometteuses dans la

immunitaire, des études utilisant des modèles

SLA.

Éléments cruciaux à considérer pour le développement d’une immunothérapie L’immunisation est l’action conférant l’immu-

(vaccination) est l’induction d’une réponse im-

nité, soit par injection d’antigènes (immunisa-

munitaire efficace contre l’antigène ciblé sans

tion active) soit par injection de sérum conte-

effets secondaires indésirables. Toutefois, une

nant des anticorps spécifiques (immunisation

telle stratégie d’immunisation doit être considé-

passive) (figure 2). Actuellement, les réponses

rée avec précaution avant d’établir des essais

immunes indésirables constituent un problème

cliniques chez l’humain étant donné le risque

majeur dans la thérapie par immunisation. Un

élevé de développement d’effets secondaires

élément souhaitable pour le développement

incontrôlables. En effet, même si certains résul-

d’une immunothérapie par immunisation active

tats bénéfiques ont été notés, une étude clinique

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NUMÉRO CRCQ Immunisation active

Périphérie

Immunisation passive

Cellules B

Jonction serrée

BHE

Cellules endothéliales

Membrane basale

1 Astrocytes activés

SNC

2

Microglie activée 3

1

2

2 2 Microglie activée

Neurone moteur

2

Anticorps anti-SOD1 SOD1 mutante/mal repliée

1) Phagocytose médiée par le fragment Fc 2) Neutralisation de SOD1 mutante/mal repliée extracellulaire 3) Neutralisation de SOD1 mutante/mal repliée à l'intérieur des neurones moteurs

Figure 2. Réaction immunitaire spécifique résultant de différentes stratégies d’immunisation L’immunisation passive avec des anticorps spécifiques contre la SOD1 mutante/mal repliée pouvant être administrés à la périphérie ou directement dans le SNC. L’immunisation active avec la protéine SOD1 mutante permet de déclencher une réponse immunitaire humorale et la production d’anticorps par les lymphocytes B. La barrière hémato-encéphalique (BHE), formée des jonctions serrées entre les cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins dans le SNC, empêche le passage des macromolécules et des agents pathogènes entre la circulation sanguine et le SNC. Dans les deux modes d’immunisation, une petite fraction d’anticorps périphériques peut traverser la BHE et provoquer différents effets bénéfiques par le biais de divers mécanismes potentiels (1 à 3). Vol.2 n°2

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NUMÉRO CRCQ

de phase 2 sur l’administration de l’antigène Ab

immunisation passive semblent donc plus ap-

chez les patients atteints de la maladie d’Alzhei-

propriées dans le développement d’immunothé-

mer a été interrompue, étant donné que 6% des

rapie spécifique puisque l’administration d’anti-

sujets de l’étude sont décédés d’une ménin-

corps peut être facilement stoppée advenant

go-encéphalite aigüe suite au traitement [25].

l’apparition d’effets secondaires indésirables.

Pour des raisons de sécurité, les approches par

Les approches d’immunisation pour la SLA causée par des mutations dans le gène SOD1 Le mauvais repliement de protéines est une

SLA sporadique n’ayant aucune mutation dans

caractéristique commune à plusieurs maladies

le gène SOD1 [7]. Cette découverte fondamen-

neurodégénératives. Dans la SLA, les diffé-

tale nous a permis d’établir pour la première fois

rentes mutations dans le gène SOD1 semblent

un lien possible entre la SLA familiale et la SLA

favoriser l’adoption de conformations anor-

sporadique ainsi que l’existence potentielle d’un

males, par les protéines mutantes ainsi pro-

mécanisme physiopathologique commun aux

duites, se traduisant en général par la formation

deux formes de la maladie, impliquant le replie-

d’agrégats cellulaires. En effet, des agrégats de

ment tertiaire anormal de la protéine SOD1. Le

SOD1 ont été détectés dans les cas de SLAF

mauvais repliement de SOD1 pourrait donc être

causée par des mutations dans le gène SOD1

la cause centrale de la maladie, par un méca-

et dans les diverses souris transgéniques SOD1

nisme qui reste à être déterminé.

mutantes [26]. De plus, grâce à la production

Suite à la découverte d’un mécanisme

d’anticorps spécifiques à certaines formes mal

pathogénique basé sur la toxicité de la protéine

repliées adoptées par la protéine SOD1, nous

mutante SOD1 sécrétée [18], plusieurs straté-

avons récemment démontré que l’on pouvait

gies d’immunisation ont été développées afin

détecter SOD1 mal repliée dans des cas de

de réduire l’accumulation de SOD1 mutante ex-

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AUDREY LABARRE ET COLL. 101

NUMÉRO CRCQ

tracellulaire. Ainsi, des protocoles d’immunisa-

n’est pas idéale pour neutraliser la très grande

tion active et passive ont été décrits et montrent

quantité de SOD1 mutante présente dans le

tous des effets thérapeutiques bénéfiques chez

système nerveux central (SNC) puisque seule

les souris immunisées [27-30]. En effet, des

une fraction des anticorps produits passera la

protocoles d’immunisation active en adminis-

barrière hémato-encéphalique. En revanche,

trant soit la protéine recombinante SOD1 mutée

l’immunisation passive par administration d’an-

(G93A), soit la protéine SOD1 WT non métal-

ticorps spécifiques anti-SOD1 mal repliée chez

lée (apoSOD1) et mal repliée, ou soit un pep-

des souris SOD1G93Ahigh, directement dans le

tide ciblant l’interface de dimérisation de SOD1

SNC, a permis de prolonger significativement

aux souris transgéniques SOD1G37R ou SOD-

la survie des souris immunisées et de retarder

1G93Alow (souris exprimant de façon modérée

l’apparition des premiers symptômes [27]. Les

la protéine SOD1 mutée) ont permis de pro-

anticorps anti-SOD1 mal repliée, reconnais-

longer significativement la survie et de retarder

sant spécifiquement la protéine SOD1 mutante/

l’apparition des premiers symptômes des souris

mal repliée et non la forme sauvage native, de-

immunisées [28-30]. Toutefois, cette approche

viennent donc des outils moléculaires uniques

n’a pas permis d’obtenir des effets bénéfiques

pour étudier l’influence du mauvais repliement

importants chez la souris SOD1G93Ahigh pré-

de SOD1 dans la pathogenèse de la maladie et

sentant un haut niveau d’expression de la pro-

ouvre la porte au développement d’une immu-

téine SOD1 mutée. Ceci n’est pas surprenant

nothérapie de type passive pour le traitement

compte tenu du niveau excessivement élevé

de la SLA.

de la protéine SOD1 mutée dans ce dernier

Les mécanismes exacts qui confèrent les

modèle animal comparativement aux souris

effets bénéfiques observés lors des différents

transgéniques SOD1G37R et SOD1G93Alow

protocoles d’immunisation ne sont pas encore

(tableau 1). En effet, une immunisation péri-

entièrement compris. En raison de l’existence

phérique (sous cutanée, intrapéritonéale, etc.)

de la protéine SOD1 mutante extracellulaire, il

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NUMÉRO CRCQ

est présumé que la phagocytose par les cel-

tie pour assurer une protection [27]. Cependant,

lules microgliales, induite par le fragment Fc,

l’administration de l’anticorps intact (Fc + Fab)

permettrait d’induire une opsonisation subsé-

est plus efficace pour prolonger la survie des

quente ou l’activation du complément afin de

souris immunisées que le fragment Fab seul.

réduire la toxicité associée à SOD1 mutante. Il

Cette donnée suggère que des mécanismes

a également été démontré que l’internalisation

différents, comme la phagocytose induite par

des anticorps dans les neurones moteurs de la

le fragment Fc et la neutralisation des épitopes

moelle épinière, suite à l’injection d’anticorps

toxiques par simple liaison de l’anticorps à la

anti-SOD1 mal repliée, pourrait favoriser la

SOD1 mutante, peuvent travailler de concert

neutralisation des propriétés toxiques de SOD1

pour atténuer la sévérité de la maladie. Cette

mutante à l’intérieur des neurones moteurs,

découverte ouvre donc la porte pour l’utilisation

diminuer l’accumulation de SOD1 mutante et

de fragments fonctionnels d’anticorps à domaine

la formation d’agrégats, ainsi que d’abaisser la

unique (scFv), aussi appelés « intrabodies ».

neuroinflammation [27]. De façon intéressante,

L’utilisation de ces « intrabodies » offre certains

l’immunisation passive à l’aide du fragment Fab

avantages pour le développement d’une immu-

des anticorps anti-SOD1 mal repliée a mené à

nothérapie, en raison de leur poids moléculaire

un prolongement notable de la durée de vie des

plus faible, une immunogénicité réduite et une

souris immunisées suggérant que le fragment

meilleure pénétration dans le système nerveux.

Fc des anticorps utilisés est dispensable en par-

Discussion et perspectives futures L’activation du système immunitaire par le biais

beaucoup de mise au point à faire avant de pas-

de l’immunisation passive représente une ave-

ser de la souris vers la mise en place d’essais cli-

nue thérapeutique intéressante pour les per-

niques chez les humains. Pour le moment, l’im-

sonnes atteintes de SLA. Par contre, il reste

munisation active n’apparaît pas être l’approche

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NUMÉRO CRCQ

la plus appropriée compte tenu du risque trop

duisant 10 à 20 fois plus de SOD1 mutante/

élevé d’effets secondaires incontrôlables qui lui

mal repliée que les patients (une seule copie du

sont associés [25]. Toutefois, le développement

gène étant défectueux), l’immunothérapie sera

d’une immunothérapie de type passive pour le

t’elle encore plus efficace dans un contexte

traitement de la SLA va demander une quantité

où l’expression de la protéine mutante/mal re-

importante d’anticorps monoclonaux humani-

pliée est beaucoup moins extrême? L’évalua-

sés et dirigés contre la protéine SOD1 mutante/

tion d’une autre question s’impose quant à la

mal repliée. Idéalement, ces anticorps devraient

voie

reconnaître spécifiquement la protéine SOD1

beaucoup d’autres agents thérapeutiques, les

mal repliée, peu importe sa conformation, sans

anticorps ont une longue demi-vie et un faible

toutefois reconnaître la forme native de type

taux de pénétration dans le système nerveux

sauvage. Ce cas de figure permettrait alors de

central lorsqu’ils sont administrés en périphérie.

développer un traitement prophylactique effi-

Le recours à des injections intrathécales via un

cace pour la majorité des cas de SLAF associés

système implantable, employées pour le traite-

aux multiples mutations décrites dans ce gène,

ment de douleurs chroniques réfractaires, pour-

ainsi que pour les cas de SLAS associés à la

rait représenter une alternative à court terme.

SOD1 mal repliée.

Toutefois, le coût de l’injection quotidienne pen-

d‘administration des anticorps. Comme

Plusieurs autres questions demeurent

dant plusieurs années d’une grande quantité

encore en suspens pour le développement opti-

d’anticorps monoclonaux humanisés coûteux

mal d’une immunothérapie dans le traitement

à produire, devient un facteur limitant impor-

de la SLA. Les résultats obtenus chez la souris

tant à prendre en considération. Le développe-

seront–ils applicables à l’humain ? Comment la

ment d’anticorps fonctionnels à domaine unique

longévité accrue de 10% observée en moyenne

(scFv) de petite taille et moins immunogéniques

chez la souris immunisée va-t-elle se traduire

capables de traverser aisément la barrière hé-

chez les patients? Les souris SLA-SOD1 pro-

mato-encéphalique laissent toutefois entrevoir

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AUDREY LABARRE ET COLL. 104

NUMÉRO CRCQ

une alternative efficace aux anticorps conven-

Le manque d’outil diagnostique ou de biomar-

tionnels. Quel serait le meilleur moment pour

queurs de progression permettant un diagnostic

commencer la thérapie? Les résultats obtenus

précoce de la SLA sporadique devient donc un

lors ces protocoles d’immunisation faits chez la

inconvénient majeur pour un traitement avant

souris suggèrent que le plus tôt serait le mieux.

l’apparition des premiers symptômes.

Conclusion L’immunothérapie offre des perspectives pro-

administration intrathécale d’anticorps monoclo-

metteuses pour le traitement de la SLA familiale

naux spécifiques à la protéine SOD1 mutante/

associée à des mutations dans le gène SOD1

mal repliée est concevable pour la vaste majorité

mais également pour le traitement de la SLA

des patients. Le développement d’outils nova-

sporadique. En effet, il a été démontré que la

teurs et l’identification de biomarqueurs pour le

protéine SOD1 mal repliée a été détectée dans

diagnostic précoce de la SLA sont donc des voies

une fraction importante des cas de SLA spora-

de recherche inévitables dans les années à ve-

diques ne présentant aucune mutation dans le

nir. Pour les cas de SLA familiale sans mutations

gène SOD1. En faisant fi du caractère invasif de

SOD1, des stratégies d’immunisation similaires

la méthode d’injection et du coût de production

pourraient être envisagées en ciblant les autres

des anticorps, un traitement prophylactique par

gènes identifiés et associés à la SLA familiale.

Remerciements et financements Les recherches du Dr François Gros-Louis sont

niveau 2 en biomodélisation et traitement des

supportées par le Fond de recherche du Qué-

maladies neurodégénératives. Madame Audrey

bec en santé (FRQS), par la Fondation GO et

Labarre est récipiendaire d’une bourse d’étude

par la Fondation des hôpitaux Enfant-Jésus et

octroyée par la Faculté de médecine de l’Uni-

St-Sacrement. De plus, le Dr Gros-Louis est ti-

versité Laval. Les auteurs ne déclarent aucun

tulaire d’une Chaire de recherche du Canada de

conflit d’intérêts.

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REVUE

Les interactions BHE/leucocytes dans la sclérose en plaques BBB-Leukocyte Interactions in Multiple Sclerosis Catherine Larochelle1,2 et Alexandre Prat1,2 Laboratoire de recherche en neuroimmunologie, Centre d’excellence en neuromique, CRCHUM, Hôpital Notre-Dame, Faculté de médecine, Université de Montréal 2 Clinique des maladies démyélinisantes, CHUM-Hôpital Notre-Dame, Département de neurologie, Faculté de médecine, 1

Université de Montréal

Correspondance Alexandre Prat, MD, PhD Directeur de l’axe des neurosciences CHUM-Hôpital Notre-Dame 1560 Sherbrooke East, Montréal, Québec, H2L 4M1 Canada 514 890-8000 poste 24734 [email protected]

Date de réception : 29 novembre 2012 Date d’acceptation : 1 février 2013

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Résumé Près de 150 ans après sa description clinique, la cause exacte de la sclérose en plaques (SEP), une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC), demeure inconnue. La contribution du système immunitaire périphérique à la formation des plaques est toutefois indéniable, et la compréhension croissante des mécanismes moléculaires sous-tendant l’infiltration du SNC par des leucocytes inflammatoires a permis de nombreuses avancées thérapeutiques. Cet article propose une revue des connaissances actuelles concernant l’interaction des cellules du système immunitaire périphérique avec la barrière hémo-encéphalique (BHE), un événement crucial dans la genèse des lésions du SNC observées dans la SEP.

Summary Nearly 150 years after its clinical description by Charcot, the exact cause of Multiple Sclerosis, an inflammatory disorder of the central nervous system, still remains elusive. The contribution of the peripheral immune system to lesion formation is however undeniable, and the understanding of the molecular mechanisms underlying the infiltration of the central nervous system by inflammatory leukocytes has led to numerous therapeutic advances. This review article focuses on the interactions between peripheral immune cells and blood-brain barrier endothelial cells, a crucial early event in Multiple Sclerosis lesion formation.

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Introduction

E

n 1866, à Paris, Charcot décrit une

lique (BHE), constitue l’événement initial ou un

nouvelle entité clinique qui se mani-

phénomène secondaire à une dysfonction du

feste par des symptômes neurolo-

compartiment central [1]. Néanmoins, la com-

giques intermittents, variés et récurrents, et

préhension croissante des mécanismes molé-

est associée en pathologie à des plaques de

culaires sous-tendant l’infiltration du SNC par

démyélinisation au niveau du système nerveux

des leucocytes inflammatoires et la formation

central (SNC). Il lui donne le nom de sclérose en

subséquente des ‘plaques’ a permis de nom-

plaques (SEP). Près de 150 ans plus tard, bien

breuses avancées tant au niveau des connais-

que l’on attribue généralement les symptômes

sances concernant la pathophysiologie de la

de la SEP à une action inappropriée du système

SEP que du traitement pharmacologique de ses

immunitaire entraînant une atteinte de la myé-

manifestations cliniques. Cet article propose

line et des axones du SNC, la cause exacte de

une revue des connaissances actuelles concer-

la SEP demeure inconnue. Le débat demeure à

nant l’interaction des cellules immunitaires avec

savoir si l’entrée de cellules immunitaires péri-

la BHE, un événement considéré crucial dans

phériques dans le SNC, normalement restreinte

la genèse des lésions du SNC observées dans

par la présence de la barrière hémo-encépha-

la SEP.

La SEP est une maladie inflammatoire du SNC associée à une perte de fonction de la BHE La SEP est une maladie inflammatoire du SNC

système immunitaire au développement de la

caractérisée par la présence de zones multifo-

SEP. Premièrement, les facteurs génétiques

cales d’infiltration leucocytaire et de démyélini-

associés au risque de développer la SEP sont

sation. Bien que la nature auto-immune de la

majoritairement impliqués dans la fonction

SEP ne soit toujours pas confirmée, plusieurs

immunitaire [2], le facteur génétique associé

facteurs appuient la contribution majeure du

au plus grand effet sur la susceptibilité (risque

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relatif 3.08) étant l’haplotype Human Leuko-

à des infiltrats immunitaires périvasculaires [7,

cyte Antigen (HLA)-DR, associé au complexe

8]. Ces leucocytes inflammatoires infiltrants re-

majeur d’histocompatibilité classe II [3]. Deu-

lâchent des facteurs toxiques et des molécules

xièmement, 90% des patients souffrant de SEP

inflammatoires qui activent et endommagent les

présentent des bandes oligoclonales au sein

cellules résidentes du SNC [9]. Ils sont donc lar-

du liquide céphalo-rachidien, témoignant d’une

gement considérés responsables du dommage

production d’anticorps au sein du SNC. Dans la

subi par les cellules gliales et neuronales, et

même veine, une étude récente suggère qu’un

subséquemment des symptômes cliniques neu-

anticorps anti-canal potassique KIR4.1 poten-

rologiques récurrents et/ou cumulatifs obser-

tiellement pathogénique serait retrouvé chez

vés chez les patients souffrant de la SEP. Dif-

46.9% des patients SEP [4]. Troisièmement, un

férentes sous-populations leucocytaires ont été

modèle animal de la SEP, l’encéphalite autoim-

incriminées dans la formation de lésions dans

mune expérimentale (EAE), est basé sur l’acti-

la SEP, dont les lymphocytes THelper, les lympho-

vation du système immunitaire périphérique en

cytes Tcytotoxiques, les cellules dendritiques et les

présence d’antigènes originaires du SNC [5]. Fi-

lymphocytes B [7, 8]. Quelle que soit leur na-

nalement, les traitements démontrés efficaces

ture, les leucocytes inflammatoires doivent tout

dans la SEP sont des immunosuppresseurs ou

d’abord pénétrer au sein du SNC et augmenter

des immunomodulateurs, tels les corticosté-

la perméabilité de la BHE pour être pathogé-

roïdes, la mitoxantrone, l’acétate de glatiramer,

niques dans la SEP [10]. La déstabilisation de la

les interférons bêta ou plus récemment le fingo-

BHE et l’infiltration périvasculaire de leucocytes

limod [6].

au niveau du SNC sont en effet considérées

Au niveau histopathologique, les plaques de

comme des événements précurseurs dans la

SEP sont caractérisées par de la démyélinisa-

formation des lésions de SEP, tel que démontré

tion, de la perte axonale, une gliose réactionnelle

par i) la présence de rehaussement des lésions

et une dysfonction focale de la BHE, associées

après injection de gadolinium, observé en ima-

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gerie par résonance magnétique [11, 12] et ii) la

suite aux traitements immunomodulateurs ou

diminution de l’incidence de nouvelles lésions

immunosuppresseurs.

La barrière hémo-encéphalique (BHE) Le SNC est considéré comme ‘immunoprivilé-

tionnelles. Les complexes macromoléculaires

gié’ puisque la présence de la BHE restreint la

formés par les JS sont attachés aux filaments

circulation des molécules et des cellules de la

d’actine du cytosquelette de la cellule endo-

périphérie vers le SNC [13]. En effet, les capil-

théliale par des molécules adaptatrices dont

laires et veinules post-capillaires du SNC sont

les zona occludens 1, 2 et 3, la cinguline et la

tapissés de cellules endothéliales spécialisées

protéine sérine kinase dépendante du calcium.

qui forment la première couche de la BHE. Cet

Les JA quant à elles sont formées de protéines

endothélium n’est pas fenêtré, présente une

telles que la cadhérine vasculaire-endothéliale

faible activité pinocytaire et exprime plusieurs

et sont liées au cytosquelette par des caténines.

molécules impliquées dans l’efflux de média-

En formant des complexes intercellulaires sem-

teurs solubles vers le sang [10, 14-17]. Il en-

blables à des fermetures éclair, les TJ et les AJ

trave donc fortement la diffusion transcellulaire

limitent la perméabilité intercellulaire de l’endo-

des éléments du sang vers le SNC et expulse

thélium capillaire du SNC.

activement les métabolites toxiques [18]. Les

Apposée à l’endothélium spécialisé de

cellules endothéliales de la BHE expriment éga-

la BHE, une lame basale endothéliale, formée

lement des molécules de jonctions serrées (JS)

de protéines de la matrice extracellulaire telles

et de jonctions adhérentes (JA) (figure 1) [10,

que les laminines 8 et 10 et le collagène type IV,

13, 14, 19-21]. Les JS sont formées par des

pose aussi entrave à la circulation moléculaire

protéines transmembranaires qui lient deux cel-

et cellulaire de la périphérie vers le SNC. Cette

lules endothéliales adjacentes. Ces protéines

lame basale délimite la première bordure de

appartiennent à la famille des claudines, des

l’espace périvasculaire [13, 22]. Des péricytes

occludines et des molécules d’adhérence jonc-

enchâssés à l’intérieur de cette lame basale

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Figure 1. Les étapes de la transmigration leucocytaire du sang périphérique vers le SNC 1- En condition physiologique, la BHE et les lymphocytes expriment peu de molécules d’adhérence/ligands. L’accès des leucocytes au SNC est hautement limité. 2- En condition inflammatoire, une augmentation de l’expression de molécules d’adhérence et de leurs ligands favorise les interactions BHE/leucocytes. Ces interactions mènent à l’adhérence des leucocytes à la BHE et à l’augmentation d’avidité des ligands leucocytaires, via les chimiokines. Les leucocytes activés sécrètent des cytokines pro-inflammatoires qui participent à l’activation endothéliale et leucocytaire, et qui favorisent le recrutement d’autres cellules immunitaires. 3- La sécrétion de cytokines et de métalloprotéinases matricielles par les leucocytes activés affecte l’intégrité des jonctions serrées et de la matrice extracellulaire, favorisant la migration intercellulaire et trans-matricielle. 4- Une fois l’espace périvasculaire atteint, les lymphocytes devront être réactivés par des cellules présentatrice d’antigène avant de pouvoir franchir la glia limitans. Les molécules inflammatoires sécrétées par les leucocytes vont activer la microglie et les astrocytes adjacents, qui contribuent à l’activation et la déstabilisation de la BHE et au recrutement d’autres cellules immunitaires.

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soutiennent quant à eux le développement [23]

la glia limitans périvasculaire, qui complète la

et le maintien des propriétés de la BHE [24].

barrière hémo-encéphalique [10, 26]. Les astro-

Entre autres, les péricytes régulent la formation

cytes eux-mêmes jouent un rôle majeur de gui-

des vaisseaux, la transcytose endothéliale, l’or-

dance et support aux cellules endothéliales de

ganisation structurelle des jonctions serrées et

la BHE. Ils influencent également la fonction de

l’apposition des pieds astrocytaires [23, 25], en

la BHE par la sécrétion de facteurs solubles qui

plus d’influencer l’expression de certaines mo-

promeuvent la stabilité et l’étanchéité de la BHE

lécules d’adhérence [23].

[26]. En condition inflammatoire comme dans la

Une deuxième lame basale dite paren-

SEP, les astrocytes peuvent toutefois également

chymateuse, formée de protéines telles que le

sécréter des molécules pro-inflammatoires qui

dystroglycan et les laminines 1 et 2, constitue

participent à la déstabilisation de la BHE et au

l’autre bordure de l’espace périvasculaire. Avec

recrutement et à l’activation de cellules immuni-

les pieds astrocytaires, qui enrobent plus de

taires [10, 26, 27].

90% des micro-vaisseaux du SNC, elle forme

Les étapes de la transmigration leucocytaire vers le SNC La présence de la BHE empêche la libre circu-

l’endothélium, avec leurs ligands, exprimés

lation de leucocytes du sang vers le comparti-

par les leucocytes. Les étapes classiques de

ment du SNC. Pour réussir à pénétrer à travers

la migration ont été décrites comme 1-roule-

la BHE jusqu’à l’espace périvasculaire, les leu-

ment-adhérence-capture, 2-activation, 3- arrêt/

cocytes doivent effectuer plusieurs étapes, cha-

rampement, 4- transmigration/diapédèse. Les

cune impliquant un échange avec les cellules

interactions entre la forme activée de l’intégrine

endothéliales de la BHE [18]. Cette diapédèse

a4b1 exprimée par les leucocytes et VCAM-

s’effectue via l’interaction séquentielle et concer-

1 exprimée par l’endothélium de la BHE sont

tée de molécules d’adhérence, exprimées par

considérées cruciales pour l’étape de capture et

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l’adhérence ferme aux micro-vaisseaux du SNC.

poussées cliniques et l’apparition de nouvelles

L’interaction entre la forme activée de LFA-1

plaques [6].

et ICAM-1 serait quant à elle impliquée dans

Après le passage à travers la BHE, le leu-

l’adhérence ferme, le rampement, la polarisa-

cocyte doit traverser la lame basale endothéliale

tion et l’extravasation des leucocytes à travers

avant de gagner l’espace périvasculaire. L’inte-

la BHE [18, 28]. L’activation des intégrines a4b1

raction des leucocytes avec les composantes

et LFA-1 exprimées à la surface des leukocytes

de la membrane basale joue également un rôle

est une étape cruciale dépendante de l’immobi-

dans la migration lymphocytaire, puisque la

lisation de chimiokines à la surface luminale de

composition en laminines semble influencer la

l’endothélium de la BHE. Via l’interaction avec

capacité de former des infiltrats inflammatoires

les récepteurs de chimiokines couplés à la pro-

[22]. Une étude récente rapportant l’interaction

téine G exprimés par les leukocytes, les chimio-

de MCAM, une molécule d’adhérence exprimée

kines induisent une signalisation intracellulaire

par les lymphocytes TH17 encéphalitogéniques

rapide qui résulte en l’activation des intégrines,

[31], avec la laminine 8 (a4b1g1) fournit une piste

augmentant l’avidité de ces dernières pour leur

quant à la nature de ces interactions [32]. Par ail-

ligand endothélial (respectivement VCAM-1 et

leurs, l’expression d’enzymes ayant la capacité

ICAM-1) [29, 30]. De nombreuses autres mo-

de dégrader les protéines de la matrice extracel-

lécules d’adhérence jouent également un rôle

lulaire, les métalloprotéinases matricielles pro-

dans la migration de certaines sous-populations

téiques (MMPs), serait plus marquée chez les

leucocytaires distinctes [10]. La pertinence cli-

patients SEP [10] et corrélerait avec la capacité

nique des interactions leucocytes/BHE dans la

leucocytaire d’invasion du SNC. Une fois dans

SEP est mise en évidence par l’efficacité thé-

l’espace périvasculaire, les leucocytes devront

rapeutique du médicament Natalizumab, un

d’abord être réactivés par des macrophages ou

anticorps monoclonal qui bloque l’interaction

des cellules dendritiques périvasculaires leur

a4b1/VCAM-1 et qui réduit de façon notable les

présentant un antigène spécifique avant d’être

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en mesure d’envahir le parenchyme cérébral en

que les lymphocytes T activés peuvent migrer

traversant la glia limitans [9], un processus lar-

vers le SNC sans égard à leur antigène spéci-

gement dépendant de la production de MMPs

fique [34]. La migration leucocytaire elle-même

par les leucocytes [33].

augmente la perméabilité de la BHE, favorisant

La BHE exprime constitutivement peu

ainsi l’infiltration leucocytaire subséquente. Par

de molécules d’adhérence, et en condition phy-

le biais de cytokines inflammatoires et d’en-

siologique très peu de cellules immunitaires ont

zymes MMPs, les cellules immunitaires peuvent

donc accès au SNC. Les lymphocytes T naïfs ou

donc parvenir à influencer la fonction des cel-

quiescents ne peuvent atteindre le parenchyme

lules endothéliales de la BHE [10].

cérébral, mais il a été précédemment démontré

Les interactions leucocytes-BHE Différents sous-types de leucocytes ont été im-

Par la suite, les lymphocytes CD4 TH17, carac-

pliqués dans la physiopathologie de la SEP et la

térisés par la production d’IL-17 sous la régula-

médiation du dommage dans le compartiment

tion du facteur de transcription RORc, ont été

du SNC. Plusieurs groupes se sont intéressés

décrits comme hautement inflammatoires et as-

aux processus régulant l’entrée dans le SNC de

sociés avec la SEP et l’EAE [9]. Des études plus

sous-populations leucocytaires inflammatoires

récentes ont permis de constater que les TH17

dans la SEP, en particulier les lymphocytes CD4

encéphalitogéniques produisent non seulement

TH17, les lymphocytes CD8 T cytotoxiques et

de l’IL-17 mais aussi de l’interféron-g et du

les cellules présentatrices d’antigènes.

GM-CSF, et expriment à la fois T-bet et RORc

Les lymphocytes CD4 TH1, caractérisés par la

[35-37]. Notre groupe a pu démontrer que les

production d’interféron-ɣ sous la régulation du

lymphocytes TH17 [38], en particulier les TH17

facteur de transcription T-bet, ont été longtemps

qui produisent également de l’interféron-g [39],

considérés comme responsables de la maladie.

migrent plus efficacement à travers la BHE que

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les lymphocytes TH1. Plusieurs raisons sous-

TH17 double-positives en induisant l’expression

tendent ce phénomène, entre autres la produc-

de molécules d’adhérence par les cellules en-

tion d’IL-17 et d’autres cytokines pro-inflamma-

dothéliales de la BHE, entre autres la molécule

toires comme l’IL-22 et l’interféron-g, qui activent

ICAM-1 mais également la molécule MCAM,

et déstabilisent l’endothélium cérébral. En effet,

aussi exprimée par les lymphocytes CD4 ayant

les cellules endothéliales de la BHE possèdent

la capacité de produire de l’IL-17 [31]. MCAM

des récepteurs pour l’IL-17, l’IL-22 [38] et l’inter-

peut présenter des interactions homophiliques

féron-g [10].

(MCAM/MCAM), et il a été démontré que l’inac-

L’IL-17 agit en augmentant significati-

tivation de MCAM permet de restreindre la mi-

vement la perméabilité de la BHE par le biais

gration des lymphocytes TH17 à travers la BHE

d’une diminution de l’expression d’occludine et

[31]. Puisque MCAM peut aussi présenter des

une perturbation de l’expression et de l’organi-

interactions hétérophiliques (MCAM/laminine 8)

sation de zona occludens-1 [38, 40], deux molé-

[32] et est associée à l’expression de la molé-

cules impliquées dans la formation des JS de la

cule ‘extracellular MMP inducer’ (EMMPRIN/

BHE. L’IL-17 augmenterait également la sécré-

CD147) [31], MCAM est probablement égale-

tion de CCL2 et CXCL8 par l’endothélium de la

ment impliquée dans le passage des TH17 à tra-

BHE [38], des chimiokines qui vont promouvoir

vers la membrane basale endothéliale.

le recrutement et la migration de lymphocytes

Bien que moins largement étudiés que

et de cellules présentatrices d’antigènes. Une

les CD4, les lymphocytes CD8 T cytotoxiques

augmentation de la formation dans les cellules

sont néanmoins retrouvés dans les lésions de

endothéliales d’espèces réactives de l’oxygène

SEP et dans le CSF des patients atteints de

affectant la machinerie contractile des cellules

SEP [41, 42]. À l’image des CD4, nous avons

endothéliales est également observée sous l’in-

pu démontrer que les CD8 qui ont la capacité

fluence de l’IL-17 [40]. L’interféron-g contribue

de transmigrer à travers la BHE produisent de

également à la capacité migratoire élevée des

l’IL-17 et de l’interféron-g, en plus de l’enzyme

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lytique granzyme B [42]. En présence de blo-

laire, dont la réponse va à son tour influencer

queurs des intégrines a4, bien que leur capa-

le phénotype des lymphocytes avec qui elles

cité à adhérer à la BHE ne semble limitée que

vont interagir [46]. Les MMPs sécrétées par les

temporairement [43], leur capacité de migration

cellules myéloïdes périvasculaires vont égale-

à travers la BHE est significativement réduite in

ment participer à la formation de brèches dans

vitro et in vivo [42].

la glia limitans [33], favorisant ainsi l’entrée de

Une fois dans l’espace périvasculaire, les

leucocytes au sein du parenchyme cérébral et

lymphocytes devront interagir avec des cellules

ultimement la formation de plaques caractéris-

présentatrices d’antigènes avant d’atteindre le

tiques de la SEP.

niveau d’activation nécessaire pour pénétrer la

L’impact des péricytes sur les interac-

glia limitans. Les cellules présentatrices d’anti-

tions BHE/leucocytes dans la SEP est encore

gène utilisent également des molécules d’adhé-

méconnu. Outre leur influence dans la formation

rence pour passer à travers la BHE, entre autres

et le maintien de la BHE, des études semblent

ALCAM, aussi utilisée par les lymphocytes ex-

démontrer des propriétés anti-inflammatoires et

primant CD6 [44], et Ninjurin-1, spécifique à la

pro-regénératrices via la phagocytose [47] de

migration des cellules myéloïdes à travers la

débris de myéline, l’inhibition des lymphocytes T

BBB [45]. Les cytokines sécrétées par l’endo-

activés et la sécrétion d’IL-10 [48]. Toutefois, en

thélium de la BHE vont influencer le phénotype

fonction du milieu, les péricytes auraient égale-

des cellules myéloïdes de l’espace périvascu-

ment la capacité de sécréter des cytokines proinflammatoires et des MMPs [49, 50].

Conclusion Chez les patients souffrant de SEP, les interac-

avec le médicament Natalizumab, on observe

tions BHE/leucocytes sont impliquées dans la

une réduction de la formation de nouvelles lé-

transmigration des leucocytes vers le paren-

sions inflammatoires démyélinisantes caracté-

chyme cérébral. En bloquant ces interactions

ristiques de la SEP ainsi qu’une diminution de

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la fréquence des poussées cliniques. Toutefois,

d’adhérence impliquées spécifiquement dans

la cible du Natalizumab, l’intégrine a4, est expri-

la transmigration de sous-populations leucocy-

mée par une vaste proportion des leucocytes

taires inflammatoires et encéphalitogéniques

et des complications infectieuses sérieuses

vers le SNC, afin de réduire la formation de

peuvent survenir en cours de traitement [51].

lésions SEP sans entraver les processus nor-

Il est donc primordial d’identifier des molécules

maux d’immunosurveillance du SNC.

Remerciements et financements Le laboratoire du Dr Prat est financé par des oc-

Sénior) des Fonds de la Recherche du Québec-

trois provenant de la Société Canadienne de la

Santé. La Dre Larochelle est la récipiendaire

Sclérose en Plaques et des Instituts Canadiens

d’une bourse post-doctorale de la Société Ca-

de Recherche en Santé. Le Dr Prat est le réci-

nadienne de la Sclérose en Plaques.

piendaire d’une Bourse de Carrière (Chercheur

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