Dr. F. Borel et Dr. J.-L. Ferrer (IBS, équipe synchrotron, UMR 5075, Grenoble). Co-cristallisation IspD / fragments. Résultats. Essais de cristallisation en cours ...
Philippe CHAIGNON Maître de conférences Faculté de chimie, Université de Strasbourg Laboratoire de Chimie Biologique et Applications Thérapeutiques Institut de Chimie de Strasbourg (UMR 7177)
ANR-16-CE39-0005-01
MENAX De nouveaux inhibiteurs de IspD comme solution contre Bacillus anthracis
ANR-16-CE39-0005-01
3
Introduction
Bacillus anthracis
Bacillus anthracis …
« Retour de l'anthrax dans les élevages bovins des Hautes-Alpes » La voie du nord 20/08/2018 « Résurgence inédite de l'anthrax dans les pâturages des Hautes-Alpes » La Dépêche 20/08/2018
Spores de Bacillus Anthracis
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Introduction
Bacillus anthracis
Bacillus anthracis …
« Retour de l'anthrax dans les élevages bovins des Hautes-Alpes » La voie du nord 20/08/2018 « Résurgence inédite de l'anthrax dans les pâturages des Hautes-Alpes » La Dépêche 20/08/2018
Spores de Bacillus Anthracis
…constitue une menace bioterroriste 5
Introduction
Isoprenoïdes
6
Introduction
Voie du MEP
Voie du methylerythritol phosphate
Voie du Mévalonate
Humains La majorité des bactéries
Champignons Apicoplaste Apicoplaste
Archaebactérie et quelques bactéries
7
Introduction
Voie du MEP
Voie du methylerythritol phosphate
Voie du Mévalonate
Humains La majorité des bactéries
Champignons Apicoplaste Apicoplaste
Archaebactérie et quelques bactéries
8
Introduction
IspD
IspD d’Escherichia coli PDB 1VGT
IspD d’Arabidopsis thaliana PDB 1W77
Plusieurs sites possibles Bon candidat pour une approche par fragment!
9
Objectifs du projet MENAX Développer de nouveaux inhibiteurs de IspD de B. anthracis en utilisant une approche par fragments
Criblage à haut débit
Approche par fragment
Images issues de Nature Rev. Drug Discov., 2004, 3, 660-672.
10
Objectifs du projet MENAX Développer de nouveaux inhibiteurs de IspD de B. anthracis en utilisant une approche par fragments
11
Résultats
Production de l’enzyme IspD
• Préparation de la souche surexprimant le gène ispD
12
Résultats
Production de l’enzyme IspD
• Préparation de la souche surexprimant le gène ispD • Production et purification des enzymes IspD de B. anthracis et d’E. coli
13
Résultats
Production de l’enzyme IspD
• Préparation de la souche surexprimant le gène ispD • Production et purification des enzymes IspD de B. anthracis et d’E. coli • Cristaux et structure de IspD de B. anthracis
14
Résultats •
Test d’activité
Développement du test d’activité.
Dosage colorimétrique avec du vert de malachite/molybdate
15
Résultats •
Test d’activité
Développement du test d’activité.
• Synthèse du substrat de IspD : le methylerythritol phosphate
16
Résultats
Sélection des fragments
17
Résultats
Sélection des fragments par SPR
Dr. D. Altschuh (IGBMC, UMR 7104-U964, Strasbourg)
18
Résultats
Sélection des fragments par SPR
Dr. D. Altschuh (IGBMC, UMR 7104-U964, Strasbourg)
19
Résultats •
Sélection des fragments par SPR
Mise au point de la méthode : Tampon / fixation de l’enzyme / % de DMSO...
20
Résultats Validation de la technique avec du CTP. [CTP] (µM) 0 4.69
Adjusted sensorgram
RU 100
9.38
80
18.7
60
Response (0 = baseline)
•
Sélection des fragments par SPR
37.5
40
20
75
0
150
-20
-40 -40
-20
0
20
40
60
80
100
Tim e (0 = bas eline )
120
140 s
300
Evalué par SPR
KD
90 ± 5 µM
Evalué par un test enzymatique
KM
22 ± 8 µM
21
Résultats
Sélection des fragments par SPR
Librairie de 497 fragments
22
Résultats
Sélection des fragments par SPR
Librairie de 497 fragments
23
Résultats
Sélection des fragments par SPR Adjusted sensorgram
RU
Test à différentes concentrations en fragment
80
Response (0 = baseline)
60
40
20
0
-20 -50
0
50
100
150
200
250 s
Tim e (0 = bas eline )
24
Sélection des fragments par SPR
Résultats Détermination du KD Adjusted sensorgram
RU 80
Response (0 = baseline)
60
40
20
0
-20 -50
0
50
100
Tim e (0 = bas eline )
150
200
250 s
Sélection d’une vingtaine de fragments
25
Résultats
Co-cristallisation IspD / fragments
Essais de cristallisation en cours Dr. F. Borel et Dr. J.-L. Ferrer (IBS, équipe synchrotron, UMR 5075, Grenoble)
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Conclusions et perspectives Adjusted sensorgram
RU 80
Response (0 = baseline)
Une première sélection de fragments a été réalisée par SPR.
60
40
20
0
-20 -50
0
50
100
150
200
250 s
Tim e (0 = bas eline )
Une seconde sélection, par cristallographie et diffraction de RX, est en cours. Informations structurales sur le/les sites de fixation des fragments dans l’enzyme
Evolution des fragments (synthèse et modélisation) et évaluation du pouvoir d’inhibition Premiers inhibiteurs de IspD de B. anthracis Développement d’inhibiteurs spécifiques de IspD de B. Anthracis 27
L’outil JCJC de l’ANR Création de l’équipe CBAT en 2014 Développement d’une nouvelle thématique : la sécurité globale Développement d’une nouvelle approche : par fragment Prise d’autonomie par rapport à cette thématique et approche.
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d'environ 13°C. - un sweat ou petit pull à manche longue. - un pantalon de sport ou collant. - des chaussures fermées de type baskets ou chaussures de marche.
Levée de fonds pour le financement de la construction de deux centrales photovoltaïques en toitures dans dans le département des Bouches-du-. Rhône (13).
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compensation pour les terres qui sont mises hors-culture (Ryan, 2000 et Ryan, 2001). ..... financement adéquat pour des objectifs définis soit un gage de succès.
