Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Recepteurs Nucléaires des Hormones Relation Structure-Fonction Dino Moras, Septembre 2010
From the molecules in functional complexes at atomic scale to their location in the cell , tissus and small animals :
The Cellular Code
1) LES RECEPTEURS NUCLEAIRES SO NT DES SERRURES PO UR L’ACCES A LA CH RO M ATINE, LES LIG ANDS EN SO NT LES CLEFS
histone désacétylase
complexe médiateur
2
histoneacétyl transférase
CoR
CoA
2 1
1
L
RXR RAR
RXR RAR
FTs
ARN pol. II
L
TRANSCRIPTIO N REPRIM EE (chromatine verrouillée)
nucléosome
TRANSCRIPTIO N ACTIVEE (chromatine déroulée)
2) LES RECEPTEURS NUCLEAIRES SERVENT PO INTS D’ANCRAG E POUR L’ASSEM BLAG DE LA M ACH INERIE TRANSCRIPTIO NNEL
L’activation de la transcription dépendante du ligand parcepteurs les ré nucléaires.
Transcriptional regulation by nuclear receptors HDAC
HAT
CoR
CoA
apo NR
holo NR
Repression
Mediator TFs ol II p complex TAF RNA P holo TB NR
Transcriptional activation
Derepression
NRs interact with numerous partners
Glass 2006 Genes Dev.
48 Nuclear Receptors in Human – Many Orphans Family NR1
NR2
NR3 NR4 NR5 NR6 NR0
Group
Nuclear Receptor Trivial Name A1, 2 TRα, β yes yes B1, 2, 3 RARα, β, γ yes yes C1, 2, 3 PPARα, β, γ yes yes D1, 2 RevErbα, β no no F1, 2, 3 RORα, β, γ yes yes H2, 3, 4 LXRα, β, FXR I1, 2, 3 VDR, PXR, CAR yes A1, 2 HNF4α, γ B1, 2, 3 RXRα, β, γ yes yes C1,2 TR2α, β E1, 3 TLX, PNR F1, 2, 6 COUP-TFI, II, III A1, 2 ERα, β B1, 2, 3 ERRα, β, γ yes yes C1, 2, 3, 4 GR, MR, PR, AR A1, 2, 3 NGFI-B, NURR1, NOR1 A1, 2 SF1, LRH1 A1 GCNF B1, 2 DAX1, SHP
LBD Crystal Known Structure Ligand
‘adopted’ orphan orphan ‘adopted’ orphan yes yes ‘adopted’ orphan yes ‘adopted’ orphan yes yes ‘adopted’ orphan no no no no no no yes yes ‘adopted’ orphan yes yes yes no yes no no no no no
orphan orphan orphan
orphan orphan orphan orphan
Structure modulaire des récepteurs nucléaires
AF1
liaison à l’ADN
cAGGTCAtttcAGGTCAg gTCCAGTaaagTCCAGTc
LBD
DBD
liaison du ligand Région charnière flexible
AF2
RXRα−RARα
ERα + estradiol H9
H1 H1 0 0
H1
AR + testosterone H9 H1
H1 H1 1 1
Multiple alignments http://bioinfo-igbmc.u-strasbg.fr/Nuclear_Receptors/ NR LBDs alignment without C. elegans NR sequences:
706 full length lbd sequences + 37 PDBs
NR LBDs alignment from all available full sequenced genomes: 489 full length lbd sequences
Homo sapiens Complete Caenorhabditis elegans
genomes
Ciona intestinalis
Drosophila melanogaster
Mus musculus
Sequence/structure to function Sequence Class I (Steroids, RXR/USP)
Class II (RAR, TR, PPAR, VDR)
Structure
H9 H1 H8
H10
H8
H10
H5
H5 H11
H3
Function ?
H9
H1
H11
H3
HOMODIMERS Class I
HETERODIMERS Class II
Dimerization and Communication Pathways in Nuclear Receptors Brelivet et al. EMBO Rep. 2004 (4): 423-9
HOMODIMERS Class I HNF4* DHR96 RXR*, USP* TR2, TR4
HETERODIMERS Class II TR** RAR** PPAR**
DHR78
RevErb, E75
TLL, PNR
E78
COUP, SVP, EAR2 ER*
ROR, HR3 EcR**
ERR* GR*, PR*, AR, MR SF1, LRH1, FTZ-F1
LXR**, FXR VDR**, PXR**, CAR
DHR39 GCNF1 Dax1, SHP All C. elegans
NGFIB, Nurr1**, NOR1 DHR38**
Class I
Monomers, Homodimers RXR steroid receptors some orphan receptors
Class II Heterodimers with RXR RAR VDR PPAR TR
MONOMERS NGFI-B
5 ’- AAPuGGTCA - 3 ’
MUTATION PuG(G/A)(T/A)CA
PuG(G/T)TCA
DUPLICATION
PALINDROMES Pi
DIRECT REPEATS DRi
Ni
Ni AGGTCA Ni AGGTCA POLARITY
C2 SYMMETRY HOMODIMERS STEROID RECEPTORS
P3
ER
ERE: PuGGTCA GR
GRE: PuG(G/A)ACA THYROID RECEPTOR
P0
RXR
TR
1 DR2 DR3
TR
0
RXR
PPAR
GR
3
Ni C2 Symmetry
HOMO-HETERODIMERS RETINOIDS , EICOSANOIDS VITAMIN D and THYROID HORMONES
ER
3 P3
INVERTED REPEATS
DR4
TRE: PuGGTCA
DR5
HOMO and HETERODIMERS COMPLEX RESPONSE ELEMENTS
RXR 1
RXR
1
RAR
2 RXR
VDR
3 RXR
TR
4 RXR
RAR
5
RXR
RAR
DR1
Integrative structural biology studies of ligand-dependent transcription regulation mediated by nuclear receptors
Solution structures (SAXS, SANS)
Crystal structures
Functional data
CryoEM
Les hétérodimères RAR-RXR & VDR-RXR liés à leurs éléments de réponse et coactivateurs
VDR : le promoteur de l’Osteocalcine
GGGTGAatgAGGACA -461 -448
DR3 VDRE
Architecture of VDR/RXR/DR3 in Solution -SAXS : ab initio envelop -Docking of atomic models from crystal structures (2 rigid bodies) -Validation by FRET et SANS
• 3D model • Conformation : asymmetric and elongated • The atomic model fits the envelope suggesting a single major conformer
Validation du modèle SAXS par spectroscopie de fluorescence FRET DR3 labeled at the 5’ or 3’ with 5/6-FAM
3’
5’ 100 ± 5 Å
110 ± 5 Å
SRC-1 peptide labeled with TMR at the C-ter Fluorescence spectra of 5’FAM labeled DR3 bound to VDR/RXR∆AB in the absence of presence of the TMRlabeled coactivator SRC-1 peptide. Spectra of the free DR3 (red), the VDR/RXRDAB/FAM-labeled DR3 (black), the VDR//RXRDAB/labeled DR3/ N-ter-TMR labeled SRC-1 (blue) and the VDR//RXRDAB/labeled DR3/ C-terTMR labeled SRC-1 (green). Insight: TMR emitting region
RXR/VDR/DR3
Cryo-microscopie électronique à 100kV – 200kV
Cryo-EM structure is consistent with SAXS data of the same sample
cryo-EM model SAXS-data Rg : 41±0.5 A Dmax 140±10 A
RAR : le promoteur du gène de RARβ2
+1
CRE -99
-92
Ap1 -83 - 78
-52
RARE -98
-36 -32-28
TATA
INR
-78
Coup-TF RE
DR5 RARE GGTTCAccgaaAGTTCA -52 -36
Stucture en solution du complexe RAR/RXR lié à l’élément de réponse du promoteur de RARβ2 (DR5) RXR RAR
CoA peptide 5’
3’
Validation par SANS (Small Angles Neutron Scattering) et FRET
La méthode de la variation de contaste D2O/H2O permet de masquer une molécule dans un complexe
Architecture des Récepteurs Nucléaires
-SAXS -Docking affinement de structures atomiques -Validation par FRET et SANS
• Modèle 3D à 25 Å de résolution • Conformation assymétrique allongée avec les LBDs positionnés sur l’ADN du coté 5’ de l’élément de réponse
Structure du complexe RXR/RAR/DR5 avec un fragment de Med1/Drip205
Caractérisation biophysique :
Architecture par SAXS:
°Stoechiométrie de 1 Med1 pour 1 dimère °Med1 est fixé exclusivement à RAR °Med1 présente une structure très allongée et flexible
Une illustration de l’importance fonctionnelle de l’assymétrie : le positionnement du site actif du coactivateur SRC1 sur les cibles (histones H3, H4)
Exemple de flexibilité et de changement conformationel :la structure cristalline de PPARγ-RXR/DR1
Chandra et al, Nature, 2008
Les structures dans le cristal et en solution sont différentes 0,0 0,00
0,02
0,03
0,05
0,06
-0,2 -0,4
PPAR/RXR cryst
PPAR/RXR SAXS
-0,6 -0,8 -1,0
exp
• La structure cristalline de PPAR/RXR (Chandra et al. Nature 2008) n’est pas en accord avec les données expérimentales en solution • La structure en solution (SAXS et FRET) correspond à un modèle assymétrique allongé comparable à ceux observés pour RAR et VDR
Crystal Structure of the PPARγ-RXRα heterodimer on DNA and a fragment of crystallographic symmetryrelated complex
The crystallographic packing contact between two complexes is mediated by the coactivator (CoA) peptide and H12 of PPARg.
The LBD with a bound Coactivator peptide (red) Nter
LBDs
DNA & DBDs
LBDs
DNA & DBDs
Ligands : • Growth factors • Neurotransmitters • Peptide hormones
Signal transduction pathways and transcriptional regulation
Membrane Receptors
Second messengers Kinase cascades cross-talk
Transcription Factors
Nuclear Receptors
P Nu cl eu s
Cy to pl as
m
RNA Polymerase
Host cell
Ligands : • Steroid hormones • Thyroid hormones • Vitamine D3 • Retinoic acid
Allosteric control of hRARα phosphorylation Gaillard et al (2006) PNAS PKA
180°
Class II
Cyclin H docking site
Cy clin H
PK
CDK7
The Retinoids Receptors
• RXRs • RARs
H9
H10
H8
H4
A H5
H7
T
- R
C
O
O
O
O
H
H
A
H3 H2
H11
9
C
- R
A
C
H6
H12 RXR Bourguet et al. (1995) Nature RAR Renaud et al. (1995) Nature
Several conformational states of RXR hRXRα H9
H10
H8
H4
H5
H9
H8
H3
H7
H10 H4 H2
H6
H11
H12
H1
H7 H5 H3
H1 1
TcUSP-EcR
H1
H9
H1
H10 H4
H8
H12
H5 H7
H3
H12 H6
hRXRα-hRARα
H11 H6
hvUSP-EcR
RAR
RXR
Klaholz et al. (1998); Nat. Struct. Biol., 5, 199-202. Egea et al. (2000); EMBO J., 19, 2592-2601.
The RARα,β,γ isotypes - distinct pharmacological targets RARα acute promyelocytic leukemia RARβ breast cancer, lung, cervical cancer (chemoprevention) RARγ skin cancer side effects of retinoids resistance to retinoids
Structural determinants of ligand specificity RARα,β,γ – isotype selectivity is based on three residues in the LBP
hRARα
hRARβ
hRARγ
RAR is selective for enantiomers
Estrogens Receptors
• ERs • ERRs
Estrogen Receptors and Estrogen-Related Receptors 1
123
ERRγ
NTD 1
ERRβ
DBD 99
59% 1
LBD (H1 – H12) 182 205
173
1
433
77% 255 287
93% 180
263
99
521
61% 302
548
595
36%
69% 1
ERβ
458
99%
ERRα ERα
207 230
181 210
63%
485
35% Heard et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14: 382
Clinical Use of Synthetic ER Ligands Tamoxifen: standard endocrine therapy for breast cancer Raloxifene: preventive for osteoporosis
Structure-Activity Relationship of Estrogen Receptor-Drug Interactions ERα LBD / DES
ERα LBD / 4-OHT
N O
OH
OH HO
Estradiol
4-Hydroxytamoxifen OH
H12
coactivator fragment
H12
N O
HO
Diethylstilbestrol
O
ERα + agonist ‘active’
ERα+ antagonist ‘inactive’
adapted from Shiau et al. (1998) Cell 95: 927
HO
S
Raloxifene
OH
Estrogen-Related Receptors - ERRs are ‘constitutive’ orphan receptors. - ERRs share target genes with ERs in some tissues (breast, bone). - ERRα and ERRγ are expressed in human breast cancer. - Diethylstilbestrol and 4-hydroxytamoxifen are ERR antagonists.
Ligand Binding to ERs and ERRs natural ligand estradiol diethystilbestrol 4-hydroxytamoxifen ERα/β
estradiol
agonist
agonist
antagonist
ERRα
not known
no binding
antagonist
no binding
ERRβ/γ
not known
no binding
antagonist
antagonist
The ERRγ LBD Adopts a Transcriptionally Active Conformation with a Coactivator Peptide Bound
H9
H1 H8
H10
H5
H3
H4 H7 H12 H11 H6
SRC1 NR box 2
Greschik et al. (2002) Mol. Cell 9: 303
The ERRγ Ligand-Binding Pocket does not Contain any Ligand
H12
H3
F450 L454 H434 F435
L268
A272
H11
L309 L345 V313 I310
H7
H5
E275 R316
Docking of Estradiol Into the Empty ERRγ Ligand-Binding Pocket H12 H3
F450 H434
H11
F435 D
L268
C B
A
L345
L309
E275 R316
V313
I310
H7
H5
Mechanism of ERRγ Inactivation by DES H12 H3
L454
H11 F435
E275
H434 L345
R316
H5 ERRγ/DES ERRγ/apo
H7
Binding of 4-OHT to ERRγ and ERα ERα/4-OHT ERRγ/4-OHT
H11
F435 L525
H3
H434 L345
E275
I424 R316
H7 H5
The Vitamin D Receptor (VDR) Function s - calcium and phosphate metabolism
- maintenance of skeleton architecture - anti-proliferative and immunomodulatory activities
Crystal Structure of the VDR LBD 1α,25(OH)2D3
Rochel, N. et al. (2000). Mol. Cell, 5: 173.
Relation Structure-Fonction • Des mutations ponctuelles peuvent affecter la fonction des récepteurs (fixation du ligand ou interaction avec les proteines partenaires) avec pour conséquence des disfonctionnements dans la régulation de l’expression de certains gênes et de nombreuses maladies notamment cancers
Natural mutations of the VDR LBD found in the syndrome of hereditary 1,25-dihydoxyvitamin D-resistant rickets
- premature stop - point mutation
Conception d’un ligand superagoniste du récepteur de la Vitamine D • La conception du ligand est basée sur l’étude de la relation structure-fonction • Le modèle de départ est obtenu à partir de la structure cristalline du VDR lié à son ligand naturel, superposée aux structures des complexes avec des molécules superagonistes trouvées par des approches classiques
Synthetic Vitamin D Analogs (20-epi Compounds) - potential applications in osteoporosis, cancer, autoimmune diseases, … R= - major side effects: hypercalcemia, hyperphosphataemia
C 8 7
6 5 4 3
HO
A 2
D H
16
22
OH
20
26
26a
25
OH
24a
23
KH1060 22 20
OH
24
O
19
1
23
1α,25(OH)2D3
15
10
26
25
27
17
11 9
20
24
R
18
12
22
H3C
24
25
23
27a 27
26
OH 27
MC1288
Ligands Adapt to the VDR Ligand-Binding Pocket
C
1α,25(OH)2D3
D 25-OH
1-OH
A
3-OH
KH 1060
- different conformations and contacts of the aliphatic chains only - the ‘superagonist’ activity of KH1060 and MC1288 complexes may be explained by higher stability and longer half-life
MC 1288
Structural Adaptation of the VDR’s LBP to the ‘Gemini’ analog
Leucine 337
IGBMC
From gene to drug
