Université de la Méditerranée – Aix-Marseille II Faculté des sciences de Luminy Ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé

Thèse

pour obtenir le titre de docteur de l’Université d’Aix-Marseille II

Discipline : Neurosciences

Présentée et soutenue par Isabelle VIRARD

Le 4 septembre 2006

Gliogenèse dans la neurohypophyse de rongeur au cours du développement et chez l’adulte

JURY

Professeur André NIEOULLON Professeur Jean-Marc MIENVILLE Docteur Jean-Léon THOMAS Professeur Emmanuel MOYSE Docteur Pascale DURBEC

Président Rapporteur Rapporteur Examinateur Directrice de thèse

Je dédie cette thèse à mes parents et à la mémoire de mes grands-parents

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Remerciements Mes premiers remerciements iront aux rapporteurs de cette thèse, Jean-Marc Mienville et Jean-Léon Thomas, qui m’ont fait l’honneur d’accepter de juger ce travail. Je leur exprime toute ma gratitude pour le temps qu’ils m’ont consacré et pour leurs commentaires constructifs. Merci également à Emmanuel Moyse et André Nieoullon, qui ont consenti à apporter leur expertise pour l’évaluation de ce travail. Ensuite, cette thèse n’aurait pu voir le jour sans la confiance et la patience de ma directrice de recherche, Pascale Durbec, à qui j’adresse ma reconnaissance la plus sincère. Toujours disponible, elle m’a fait profiter de ses vastes connaissances et de sa maîtrise de nombreux savoir-faire. Alliant imagination et rigueur scientifique, elle développe des projets solides, et j’aimerais pouvoir continuer à bénéficier de ses précieux conseils dans l’avenir. Je tiens aussi à remercier tous les membres –passés et présents– de l’équipe Durbec et des laboratoires voisins, pour leur agréable compagnie et pour les riches échanges – scientifiques, philosophiques, gastronomiques– que nous avons eus. Je garderai longtemps le souvenir de Florence (quel dynamisme !), Xavier (l’Homme de l’équipe), Myriam (toujours zen), Cristina (au rire éclatant), Judith (la vraie Québécoise), Françoise P. (la douce), Mircea (le moins doux), Gilberte (toujours en forme), Karine (discrète mais rieuse), Vincent (toujours prêt à offrir des petits gâteaux), Elodie et David (les athlètes), Fabienne (acharnée au travail), Bernie (échange voiture contre légumes), Paolo (si inspiré par l’hypophyse !), Jean-Paul (d’une persévérance exemplaire), Sandrine, Carole, Erik, Emilie, Emeline, Elsa, les trois Céline, Angélique, Claire… Un merci très chaleureux à tous mes autres amis (Valérie la courageuse relectrice, Sophie, Gaspard, Marie L., Guillaume, Elodie, Marie C., Daï, plus tous ceux restés outreAtlantique), qui m’ont permis de passer ces années de doctorat dans la bonne humeur. Bien entendu, je ne saurais terminer cette liste sans adresser un remerciement particulier à Francis, qui m’a soutenue tout au long de mes interminables études… et qui, je l’espère, continuera à le faire pendant de nombreuses années. Ce mémoire marque pour moi la fin d’une époque : l’aboutissement de mes études et le terme de mon passage à Marseille. Merci à tous d’avoir été à mes côtés durant cette période de ma vie, et au plaisir de vous revoir, ici ou ailleurs ! iii

Table des matières REMERCIEMENTS........................................................................................ III TABLE DES MATIERES ................................................................................IV PRINCIPALES ABREVIATIONS.............................................................. VIII LISTES DES FIGURES ET TABLEAUX....................................................... X INTRODUCTION ............................................................................................... 1 A. LES CELLULES GLIALES ET LA GLIOGENESE.................................... 1 I. La glie, composante majeure du système nerveux central.............................................. 1 1. Macroglie et microglie ........................................................................................................... 2 2. Les différents types de macroglie du SNC ............................................................................. 3 a. Astrocytes......................................................................................................................................... 3 b. Oligodendrocytes ............................................................................................................................. 4 c. Les autres types de cellules gliales................................................................................................... 5 i. Pituicytes ...................................................................................................................................................... 5 ii. Cellules épendymaires ................................................................................................................................. 6 iii. Tanycytes .................................................................................................................................................... 6 iv. Glie de l’épiphyse........................................................................................................................................ 7 v. Glie radiaire................................................................................................................................................. 7 vi. Glie réactionnelle........................................................................................................................................ 8

II. Le développement des cellules gliales du SNC........................................................... 10 1. La spécification des cellules gliales ..................................................................................... 10 a. La neurulation et le développement du tube neural........................................................................ 10 b. Mécanismes moléculaires de l’établissement des axes antéropostérieur et dorsoventral du tube neural ................................................................................................................................................. 12 i. Polarité antéropostérieure.......................................................................................................................... 12 ii. Polarité dorsoventrale ............................................................................................................................... 13

c. Zones de spécification gliale dans le tube neural ........................................................................... 14

2. Les différents types de précurseurs gliaux du SNC.............................................................. 16 a. Définition des cellules souches et précurseurs neuraux ................................................................. 16 b. Techniques d’identification des cellules souches et précurseurs neuraux...................................... 16 c. Caractéristiques des différents types de cellules souches et de précurseurs gliaux ........................ 19 i. Cellules neuroépithéliales (NEP)................................................................................................................ 20 ii. Précurseurs restreints au lignage glial (Glial Restricted Precursors ou GRP)......................................... 20 iii. Glie radiaire ............................................................................................................................................. 21 iv. Cellules souches sensibles à l’EGF........................................................................................................... 21 v. Progéniteurs O-2A/OPC ............................................................................................................................ 22 vi. Précurseurs d’astrocytes (Astrocyte Precursor Cells ou APC)................................................................. 23 vii. Précurseurs de motoneurones et d’oligodendrocytes (Motor Neuron-Oligodendrocyte Precursors ou MNOP)........................................................................................................................................................... 23

3. Les lignages gliaux au cours du développement du SNC .................................................... 26 a. Définition du lignage glial : modèle de restriction progressive des potentiels ............................... 26 b. Techniques d’analyse des lignages neuraux................................................................................... 27 c. Quelques relations établies de lignages gliaux ............................................................................... 29

III. Gliogenèse dans le SNC adulte .................................................................................. 32 1. Cellules souches adultes....................................................................................................... 33 2. Cellules NG2+ (« OPC adultes ») ........................................................................................ 34 3. Autres sources de gliogenèse adulte..................................................................................... 37

iv

B. LA NEUROHYPOPHYSE DE RONGEUR COMME MODELE D’ETUDE DU LIGNAGE GLIAL .................................................................................... 38 I. Brève anatomie de l’hypophyse.................................................................................... 38 1.Neurohypophyse.................................................................................................................... 38 2. Adénohypophyse.................................................................................................................. 38 3. Lobe intermédiaire ............................................................................................................... 39

II. Composition cellulaire de la neurohypophyse............................................................. 40 1. Axones.................................................................................................................................. 40 2. Vaisseaux sanguins .............................................................................................................. 41 3. Pituicytes .............................................................................................................................. 41

III. Formation ontogénique .............................................................................................. 42 1. Développement des lobes..................................................................................................... 42 2. Différenciation des constituants cellulaires de la neurohypophyse...................................... 44

IV. Physiologie de la neurohypophyse............................................................................. 45 1. Hormones neurohypophysaires ............................................................................................ 45 2. Stimulation et plasticité morpho-fonctionnelle dans la neurohypophyse............................. 46

C. HYPOTHÈSES DE TRAVAIL ................................................................... 49 RESULTATS ..................................................................................................... 50 A. ARTICLE 1 : DES PRECURSEURS D’OLIGODENDROCYTES GENERENT DES PITUICYTES IN VIVO AU COURS DU DEVELOPPEMENT DE LA NEUROHYPOPHYSE (VIRARD ET AL. 2006)....................................................................................... 50

I. Approche expérimentale ............................................................................................... 50 II. Résumé des résultats.................................................................................................... 50

B. ARTICLE 2 : CARACTERISATION DE POPULATIONS HETEROGENES DE PITUICYTES ET LEUR IMPLICATION DANS LA GLIOGENESE INDUITE PAR LA DESHYDRATATION DANS LA NEUROHYPOPHYSE DE RAT ADULTE (VIRARD ET AL., EN PREPARATION).............................................................................................. 54

I. Approche expérimentale ............................................................................................... 54 II. Résumé des résultats.................................................................................................... 54

DISCUSSION ET PERSPECTIVES............................................................... 56 A. GENESE DES PITUICYTES AU COURS DU DEVELOPPEMENT DE LA NH ............ 56 I. Etablissement d’une relation de lignage entre OPC périnataux et pituicytes ............... 56 II. Hypothèses sur l’origine et la migration des OPC de la NH périnatale ...................... 57 1. Recherche du site d’origine des OPC de la NH ................................................................... 58 2. Recherche de signaux de migration des OPC dans la NH.................................................... 59 3. Existence possible de sous-populations d’OPC dans la NH périnatale................................ 61

III. Contrôle de la différenciation des OPC périnataux en pituicytes .............................. 62 1. Provenance des facteurs de différenciation en pituicytes..................................................... 63 2. Identité potentielle des facteurs de différenciation............................................................... 64

v

B. LES PITUICYTES ADULTES : UNE POPULATION GLIALE HETEROGENE ET PROLIFERATIVE ................................................................................................. 66 I. Hétérogénéité de la population de pituicytes ................................................................ 66 1. Existence de sous-populations de pituicytes définies par des marqueurs astrocytaires ....... 66 2. Découverte de pituicytes pdgfrα+ ........................................................................................ 67 3. Présence de progéniteurs gliaux et absence de cellules souches neurales dans la NH adulte .................................................................................................................................................. 68

II. Hypothèse quant à l’origine développementale des cellules pdgfrα+ ......................... 69 III. Lignage présumé entre cellules pdgfrα+ et pituicytes S100+ chez l’adulte............... 70 IV. Prolifération et mort cellulaire dans la NH adulte ..................................................... 72 V. Régulation de la prolifération cellulaire dans la NH ................................................... 74

CONCLUSION : APPORTS DE L’ETUDE DE LA NH A LA COMPREHENSION DE LA GLIOGENESE DANS LE SNC .................... 76 A. INTERETS ET LIMITES DE LA NH COMME MODELE D’ETUDE DE LA GLIOGENESE : ASPECTS TECHNIQUES ................................................................. 76 B. APPLICATION DES MEMES STRATEGIES A L’ETUDE D’AUTRES ZONES DE GLIOGENESE ...................................................................................................... 76 C. MISE EN EVIDENCE DE L’HETEROGENEITE DES CELLULES GLIALES ET DE LA COMPLEXITE DE LEURS LIGNAGES ..................................................................... 77 ANNEXE : RESULTATS COLLABORATIFS ............................................. 79 A. MIGRATION ET DIFFERENCIATION DES CELLULES DE LA ZONE SOUSVENTRICULAIRE DE SOURIS APRES TRANSPLANTATION DANS DIFFERENTES REGIONS DU CERVEAU ADULTE ......................................................................... 79

I. Introduction................................................................................................................... 79 1. Neurogenèse adulte : le système ZSV-RMS-BO ................................................................. 79 2. Intérêt pour la thérapie cellulaire.......................................................................................... 80 3. Modèle de transplantation hétérotypique pour étudier les potentialités des cellules de ZSV .................................................................................................................................................. 81

II. Résultats....................................................................................................................... 81 I. Article 3 : Conversion gliale de précurseurs neuronaux issus de la zone sous-ventriculaire après transplantation ectopique dans le cerveau adulte (Seidenfaden et al. 2006)................... 81 2. Article 4 : Potentiel de migration et de myélinisation de progéniteurs neuraux de la zone sous-ventriculaire dans les faisceaux de matière blanche du cerveau de rongeur adulte (Cayre et al. 2006)................................................................................................................................ 82

III. Discussion .................................................................................................................. 84 1. Les cellules de la ZSV migrent efficacement le long des fibres sous-corticales.................. 84 2. Les cellules de la ZSV ont un potentiel neurogénique limité hors du système ZSV-RMS-BO .................................................................................................................................................. 85 3. Intérêt thérapeutique des cellules de la ZSV pour les maladies démyélinisantes ................ 86

IV. Conclusion ................................................................................................................. 88

vi

B. UTILISATION DE MARQUEURS GLIAUX DANS L’ETUDE DES GLIOMES HUMAINS .......................................................................................................................... 89 I. Introduction................................................................................................................... 89 1. Définition des gliomes ......................................................................................................... 89 2. Classification des gliomes selon l’OMS .............................................................................. 89 3. Classification de l’hôpital Sainte-Anne................................................................................ 89 4. Approche moléculaire .......................................................................................................... 90 5. Utilisation de marqueurs gliaux dans la classification des gliomes ..................................... 90

II. Résultats....................................................................................................................... 91 1. Article 5 : Expression des gènes olig commune aux gliomes et aux précurseurs d’oligodendrocytes (Bouvier et al. 2003)................................................................................. 91 2. Article 6 : Pertinence des profils d’expression de filaments intermédiaires et de facteurs de transcription pour comprendre l’histogenèse des gliomes (Colin et al., soumis)..................... 91

III. Discussion .................................................................................................................. 92 1. Importance diagnostique de profils d’expression de marqueurs gliaux ............................... 92 2. Cellules souches neurales et cellules progénitrices dans les gliomes : présence et rôle présumé dans l’oncogenèse ...................................................................................................... 93

IV. Conclusion ................................................................................................................. 95

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................ 96

vii

PRINCIPALES ABREVIATIONS A2B5

Anticorps monoclonal dirigé contre des gangliosides membranaires

AH

AdénoHypophyse

APC

Astrocyte Precursor Cell : précurseur d’astrocyte

ARA-C

β-D-ARAbinofuranosylCytosine

bHLH

basic Helix-Loop-Helix domain : domaine hélice-boucle-hélice basique

BMP

Bone Morphogenetic Proteins : protéines morphogénétiques osseuses

BrdU

BromoDésoxyUridine

BSA

Bovine Serum Albumin : albumine de sérum bovin

CNP

Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase : phosphodiestérase de nucléotides cycliques

CNTF

Ciliary NeuroTrophic Factor : facteur neurotrophique ciliaire

dm20

Un transcrit du gène plp

DMEM

Milieu de Eagle modifié par Dulbecco

DNase

DésoxyriboNucléase

E…

Jour Embryonnaire …

EAE

Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale

EGF

Epidermal Growth Factor : facteur de croissance épidermique

FACS

Fluorescence-Activated Cell Sorting : Tri cellulaire à fluorescence

FCS

Fetal Calf Serum : sérum de veau foetal

FGF

Fibroblast Growth Factor : facteur de croissance fibroblastique

GalC

GalactoCérébroside

GFAP

Glial Fibrillary Acidic Protein : protéine gliale fibrillaire acide

GFP

Green Fluorescent Protein : protéine verte fluorescente

GGF

Glial Growth Factor : facteur de croissance glial

GRP

Glial Restricted Precursor : précurseur restreint au lignage glial

IgG, IgM

Immunoglobuline G, M

ILB4

Isolectine B4

lacZ

Gène de la β-galactosidase

LI

Lobe Intermédiaire

MACS

Magnetic Associated Cell Sorting : tri cellulaire magnétique (nom déposé)

MAG

Myelin-Associated Glycoprotein : glycoprotéine associée à la myéline

MBP

Myelin Basic Protein : protéine basique de la myéline

MenB

Anticorps dirigé contre PSA-NCAM viii

MNOP

Motor Neuron-Oligodendrocyte Precursor : précurseur de motoneurone et d’oligodendrocyte

MOG

Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein : glycoprotéine de la myéline des oligodendrocytes

NCAM

Neural Cell Adhesion Molecule : molécule neurale d’adhésion cellulaire

NEP

NeuroEpithelial Precursor : précurseur neuroépithélial

NG2

Nerve/Glial antigen 2 : Antigène nerveux/glial 2

NH

NeuroHypophyse

NRP

Neuronal Restricted Precursor : précurseur restreint au lignage neuronal

NT3

NeuroTrophin 3 : neurotrophine 3

O4

Anticorps dirigé contre des sulfatides membranaires

Olig

Oligodendrocyte LIneage Gene : gène du lignage oligodendrocytaire

OPC

Oligodendrocyte Precursor Cell : précurseur d’oligodendrocyte

P…

Jour Postnatal…

PBS

Phosphate-Buffered Saline : solution saline tamponnée au phosphate

PDGF

Platelet-Derived Growth Factor : facteur de croissance dérivé des plaquettes

PDGFRα

Récepteur alpha du PDGF-AA

PF ou PFA

ParaFormaldéhyde

PLP

ProteoLipid Protein : protéine protéolipidique

pMN

Domaine de spécification des motoneurones dans le tube neural

Progéniteur

Progéniteur d’Oligodendrocyte et d’Astrocyte de type 2

O-2A PSA-NCAM

Forme polysialylée de NCAM

RMS

Rostral Migratory Stream : courant rostral de migration

Shh

Sonic HedgeHog

SNC

Système Nerveux Central

SVZ

SubVentricular Zone : zone sous-ventriculaire

Tuj1

Anticorps monoclonal dirigé contre la βIII tubuline

TUNEL

Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling (marquage de l’ADN fragmenté des cellules en apoptose)

VEGF

Vascular Endothelial Growth Factor : facteur de croissance de l’endothélium vasculaire

ZSV

Zone Sous-Ventriculaire

ix

Listes des figures et tableaux Figure 1 : Le décours temporel des phases de neurogenèse, d’astrogenèse et d’oligodendrogenèse ................................................................................................................ 10 Figure 2 : Formation du tube neural chez les vertébrés. ......................................................... 11 Figure 3 : Les vésicules du tube neural et leurs structures dérivées chez l’adulte.................. 11 Figure 4 : Induction de l’axe antéropostérieur dans le tube neural. ........................................ 12 Figure 5 : Induction de domaines de spécification des progéniteurs neuraux par l’expression dorsale des BMP et ventrale de Shh dans la moelle épinière................................................... 13 Figure 6 : Représentation schématique du patron d’expression de plp/dm20 dans l’embryon de souris à E12,5. ..................................................................................................................... 14 Figure 7 : Origine restreinte des précurseurs d’oligodendrocytes dans le tube neural ventral de souris à E12,5 ...................................................................................................................... 15 Figure 8 : Spécification des précurseurs d’oligodendrocytes et d’astrocytes dans des régions distinctes du tube neural........................................................................................................... 15 Figure 9 : Principe d’analyse clonale de neurosphères pour mettre en évidence la présence de cellules souches neurales.......................................................................................................... 18 Figure 10 : Restriction progressive des potentialités cellulaires au cours d’un lignage ......... 26 Figure 11 : Méthodes in vivo d’analyse des lignages neuraux du SNC .................................. 29 Figure 12 : Relations de lignage possibles entre les différents précurseurs gliaux au cours du développement du SNC............................................................................................................ 31 Figure 13 : Origine développementale des cellules souches de la ZSV adulte....................... 34 Figure 14 : Anatomie de l’hypophyse..................................................................................... 39 Figure 15 : Développement embryonnaire de l’hypophyse de rongeur.................................. 43 Figure 16 : Stimulation et effets de la sécrétion d’hormones neurohypophysaires ................ 45 Figure 17 : Action des hormones impliquées lors d’une déshydratation ou un excès de sel.. 47 Figure 18 : Changements morphologiques au cours d’une stimulation de la NH .................. 48 Figure 19 : Le lignage oligodendrocytaire .............................................................................. 51 Figure 20 : Analyse du lignage des pituicytes grâce à des souris olig1-cre/RosaLacZ .......... 53 Figure 21 : Analyse du lignage des cellules pdgfrα+ grâce à des souris pdgfrα-creER/Rosa26GFP .......................................................................................................................................... 71 Figure 22 : Hypothèse sur la régulation du nombre de cellules dans la NH adulte ................ 73 Figure 23 : Neurogenèse dans le système olfactif de rongeur adulte...................................... 80 Tableau 1 : Les types de cellules macrogliales du SNC adulte ................................................ 9 Tableau 2 : Correspondance entre les stades de la seconde moitié du développement embryonnaire chez la souris et le rat........................................................................................ 19 Tableau 3 : Types de cellules souches et précurseurs générant de la glie au cours du développement du SNC de rongeur ......................................................................................... 25 Tableau 4 : Les types cellulaires de la NH de rat adulte......................................................... 42 Tableau 5 : Classification des gliomes selon l’OMS .............................................................. 89

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Science is far from a perfect instrument of knowledge. It’s just the best we have. Carl Sagan The Demon-Haunted World

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INTRODUCTION Longtemps négligées au profit des neurones, les cellules gliales jouent pourtant des rôles fondamentaux dans le fonctionnement du système nerveux. A présent, de nombreuses recherches sont en cours pour dévoiler les mystères de ces cellules, tant au niveau de leur fonction que de leur développement. Lors de mes études doctorales, je me suis particulièrement intéressée aux progéniteurs gliaux, en prenant comme modèle le lobe postérieur de l’hypophyse, ou neurohypophyse (NH). J’ai d’abord cherché à comprendre l’origine développementale des pituicytes, les cellules gliales de la NH. Par ailleurs, dans certaines conditions physiologiques, la NH adulte subit des changements morphologiques et fonctionnels importants, accompagnés par la formation de nouvelles cellules gliales. J’ai donc voulu tester l’hypothèse que cette structure pourrait constituer une source de cellules souches ou progénitrices, responsables de cette gliogenèse adulte. Afin de situer ce travail, il convient dans un premier temps de résumer les connaissances actuelles sur les cellules gliales et en particulier sur leur origine développementale. J’aborderai dans un second temps l’anatomie et l’histologie de la NH, le développement de ses constituants, ainsi que ses propriétés physiologiques particulières. Suivront alors un exposé et une discussion de mes résultats principaux sur les progéniteurs gliaux trouvés dans la NH au cours du développement et chez l’adulte. Pour terminer, je présenterai des travaux faits dans le cadre de collaborations. Ils s’inscrivent dans la continuité de mes études sur les cellules progénitrices et les lignages gliaux dans la NH, tout en y ajoutant une dimension clinique. En effet, ils concernent d’une part les cellules souches de la zone sous-ventriculaire (ZSV) et leur utilisation potentielle pour le traitement de maladies neurodégénératives et, d’autre part, l’utilisation de marqueurs gliaux dans l’analyse des gliomes humains.

A. LES CELLULES GLIALES ET LA GLIOGENESE I. La glie, composante majeure du système nerveux central Le terme de « cellules gliales », ou encore « neurogliales », désigne les cellules non neuronales du système nerveux. Dans le système nerveux central (SNC) des vertébrés, elles surpassent en nombre les neurones, dans une proportion de 10 à 50 cellules gliales par neurone (Kandel & Schwartz 1985). C’est Rudolf Virchow qui, au XIXe siècle, les a baptisées « neuroglie » (Nervenkitt), pensant qu’elles constituaient une sorte de glue pour maintenir 1

l’assemblage des neurones (Virchow 1859, cité dans Dermietzel & Spray 1998). Comme les cellules gliales ne présentent pas de propriétés électrophysiologiques aussi manifestes que celles des neurones, on a longtemps cru que leur fonction consistait principalement à soutenir les neurones, à leur apporter des éléments nutritifs et à maintenir l’homéostasie du système nerveux pour protéger les neurones fragiles (Kandel & Schwartz 1985). Cependant, des recherches récentes ont révélé leur rôle actif dans d’autres processus fondamentaux, par exemple la neurotransmission et la plasticité synaptique (Yang et al. 2003; Araque & Perea 2004). De plus, plusieurs équipes ont montré que les cellules souches qui permettent la genèse de nouveaux neurones chez l’animal jeune et adulte ont des caractéristiques de cellules gliales (Doetsch et al. 1999; Alvarez-Buylla et al. 2001; Namba et al. 2005). Depuis ces travaux, l’étude de la glie est l’objet d’un intérêt sans cesse grandissant. La présente thèse porte sur des cellules gliales particulières du SNC, les pituicytes, et plus précisément sur le lignage dont elles seraient issues au cours du développement et chez l’adulte.

1. Macroglie et microglie On classe les cellules gliales en deux grandes catégories : la microglie et la macroglie. Comme leur nom le laisse supposer, cette distinction est fondée sur une différence de taille entre ces deux types cellulaires. Capable de phagocytose, la microglie serait l’équivalent des macrophages dans le SNC. Lors d’une lésion au cerveau ou à la moelle épinière, son taux de prolifération augmente de façon significative (Graeber et al. 1988). Les cellules microgliales alors activées migrent pour atteindre le lieu de la blessure et aider à sa réparation (Kreutzberg 1996; Streit 2000). L'anticorps monoclonal OX42 et l’isolectine B4 tirée de Griffonia simplicifolia (ILB4) marquent la microglie aussi bien activée phagocytaire que quiescente (Robinson et al. 1986; Streit & Kreutzberg 1987; Ling et al. 1990). A la différence des cellules macrogliales, qui dériveraient de l’ectoderme, la microglie proviendrait probablement des précurseurs des monocytes du sang et donc du mésoderme (Streit 2001). De par cette origine distincte, on exclut souvent la microglie de l’ensemble des cellules gliales et le mot « glie » est alors utilisé au lieu de « macroglie ». Le présent travail de thèse portant sur un type particulier de macroglie, je n’approfondirai pas davantage la présentation de la microglie. Par ailleurs, le terme « cellule neurale » est employé pour englober à la fois les neurones et les cellules macrogliales, donc toutes les cellules du système nerveux à l’exclusion de la microglie et des cellules des vaisseaux sanguins. 2

2. Les différents types de macroglie du SNC Il existe une grande diversité de cellules macrogliales, dont les deux principaux types sont les astrocytes et les oligodendrocytes. Par souci de clarté, je ne détaillerai ici que les cellules macrogliales du SNC et omettrai volontairement les cellules de Schwann et les cellules satellites du système nerveux périphérique. Je tiens à souligner que, comme pour toute classification, cette présentation synthétique ne rend pas bien compte de l’hétérogénéité importante qui peut exister au sein de chaque catégorie de cellules gliales.

a. Astrocytes Cellules macrogliales les plus abondantes, les astrocytes tirent leur nom de leur forme étoilée. Ce sont en effet des cellules très ramifiées, dont les prolongements sont souvent apposés aux vaisseaux sanguins (Raine 1999). Elles peuvent ainsi contrôler la vasoconstriction (Koehler et al. 2006) et constituent un élément clé de la barrière hématoméningée (Abbott 2002), frontière de nature physico-chimique qui restreint le passage des cellules immunitaires et la diffusion des molécules hydrosolubles entre la circulation sanguine et le SNC (Ganong 1977; Prat et al. 2001). Les astrocytes ont aussi une fonction nourricière envers les neurones et les oligodendrocytes (Deitmer 2001; Goldman 2004). Ils régulent également l’environnement chimique des neurones : par exemple, ils en retirent les ions K+ en excès et recyclent les neurotransmetteurs libérés durant la transmission synaptique (Kandel & Schwartz 1985; Simard & Nedergaard 2004). En fait, il est maintenant établi que les astrocytes modulent grâce à des gliotransmetteurs la formation des synapses au cours du développement (Ullian et al. 2004), ainsi que leur maintien et leur efficacité chez l’adulte (Kang et al. 1998; Araque et al. 1999; Ullian et al. 2001). Classiquement, la morphologie permet de différencier les astrocytes protoplasmiques et les astrocytes fibreux. Ces derniers comptent de nombreux filaments intermédiaires tandis que les astrocytes protoplasmiques ont des prolongements courts et plus épais qui contiennent peu de filaments. En ce qui concerne leur distribution, les astrocytes fibreux semblent concentrés dans la substance blanche et les protoplasmiques, dans la substance grise, où ils sont spécialement associés aux synapses (Kandel & Schwartz 1985). En plus de cette classification morphologique, il n’est pas impossible qu’il existe une certaine diversité parmi les astrocytes, notamment selon les régions étudiées, mais elle demeure méconnue (Rao 2004a). De manière générale, les astrocytes sont répartis dans tout le SNC, avec leurs corps cellulaires séparés dans l’espace, chaque astrocyte couvrant un domaine propre (Bushong et al. 2002). Les astrocytes forment en fait une « matrice », un réseau de cellules connectées 3

entre elles par des jonctions communicantes qui permettent le passage du calcium et d’autres petites molécules (pour une revue, voir Saez et al. 2003). Par conséquent, la stimulation d’un astrocyte à un endroit précis (par exemple par du glutamate en provenance de neurones voisins) peut entraîner une vague calcique qui se propage de cellule en cellule (Haydon 2001). La protéine gliale fibrillaire acide (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP) est de loin le marqueur le plus utilisé pour identifier les astrocytes (Bignami et al. 1972), bien qu’elle soit exprimée moins fortement dans les astrocytes protoplasmiques de la substance grise. D’autres marqueurs fréquents, considérés comme moins spécifiques que GFAP, sont la protéine liant le calcium S100B, la synthétase de glutamine (GS) et les transporteurs de glutamate GLAST et GLT-1 (EAAT2 chez l’humain). Il existe aussi en culture des astrocytes dits de type 2, distincts des autres astrocytes (de type 1) par leur morphologie étoilée et leur expression conjointe de GFAP, de vimentine et de l’antigène d’A2B5 (Raff et al. 1983a; Raff et al. 1984). Soulignons que certaines cellules dont la morphologie rappelle celle des astrocytes n’expriment pas tous ces marqueurs et, inversement, que ces molécules sont parfois retrouvées dans des cellules très différentes des astrocytes (Kimelberg 2004). Pour cette raison, il est indispensable d’utiliser une combinaison de marqueurs pour identifier clairement une population cellulaire donnée.

b. Oligodendrocytes Les oligodendrocytes sont de petites cellules gliales munies elles aussi de prolongements. Ils forment une gaine de myéline en entourant ces prolongements autour des axones du SNC. La myéline, constituée de lipides et de protéines, a pour fonction d’isoler les axones et ainsi d’améliorer la conduction de l’influx nerveux (Kandel & Schwartz 1985). Les oligodendrocytes sont présents dans tout le SNC mais sont moins abondants dans la substance grise que dans la blanche, qui tire d’ailleurs son nom de la couleur de la myéline. Différents sous-types d’oligodendrocytes sont définis d’après des caractéristiques morphologiques et biochimiques, notamment le diamètre des axones qu’ils myélinisent (détaillées dans les revues de Miller (2002) et Le Bras et al. (2005)). D’une manière générale, les oligodendrocytes matures myélinisants sont reconnus par des marqueurs de constituants de la myéline, en particulier la protéine basique de la myéline (Myelin Basic Protein, MBP), le protéolipide PLP (ProteoLipid Protein), les glycoprotéines MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) et MAG (Myelin-Associated Glycoprotein) et la phosphodiestérase CNP (2’,3’-Cyclic Nucleotide 3’-Phosphodieserase) (Lazzarini 2004). Il existe aussi des gènes exprimés à la fois par les oligodendrocytes matures et leurs précurseurs 4

qui servent donc de marqueurs pour tout le lignage oligodendrocytaire, comme ceux des facteurs de transcription Sox10, Olig1 et Olig2 (Wegner 2001). Enfin, d’autres marqueurs sont essentiellement utilisés sur des oligodendrocytes maintenus en culture, par exemple les anticorps O4 et GalC (GalactoCerebroside) (Sommer & Schachner 1981; Ranscht et al. 1982).

c. Les autres types de cellules gliales Plusieurs types de cellules gliales ont des propriétés qui les distinguent au moins partiellement des astrocytes et des oligodendrocytes. Elles sont présentes dans une fenêtre de temps limitée au cours du développement ou alors dans des zones restreintes du SNC. C’est notamment le cas des pituicytes, les cellules gliales de la neurohypophyse, sujet central de la présente thèse. Mentionnons que certaines de ces populations gliales particulières, à savoir les pituicytes, les tanycytes, la glie de l’épiphyse et les glies de Bergmann et de Müller, ainsi que la glie engainante du système olfactif (appartenant au système nerveux périphérique), sont parfois regroupées sous le terme d’aldynoglie, en référence à leur capacité à favoriser la pousse neuritique (Gudino-Cabrera & Nieto-Sampedro 1999).

i. Pituicytes

Le terme « pituicytes » désigne les cellules de la glande pituitaire, l’hypophyse, et plus spécifiquement les cellules gliales de sa partie postérieure, aussi appelée neurohypophyse (NH) (Bucy 1932). Situées notamment au niveau des contacts entre les terminaisons axoniques hypothalamiques et les vaisseaux sanguins, elles joueraient un rôle de régulation de la sécrétion de neurohormones qui sera détaillé dans la deuxième partie de cette introduction. Au vu de colorations histologiques classiques, les pituicytes ont d’abord été considérés comme des cellules bien distinctes des astrocytes (Bucy 1932). Cependant, la tendance actuelle veut qu’ils soient des astrocytes spécialisés puisqu’ils expriment des marqueurs retrouvés dans les cellules du lignage astrocytaire tels GFAP (Salm et al. 1982; Velasco et al. 1982), S100B (Cocchia & Miani 1980) ou vimentine (Marin et al. 1989).

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ii. Cellules épendymaires

Les cellules épendymaires constituent un deuxième exemple de cellules gliales particulières. De morphologie variée, mais souvent ciliée, les cellules épendymaires sont reconnaissables à leur localisation. Elles forment en effet une monocouche qui borde les parois des ventricules cérébraux et du canal central de la moelle épinière (Kandel & Schwartz 1985). Leur fonction première est de constituer une barrière entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le fluide extracellulaire du SNC, mais elles semblent également remplir d’autres rôles (Bruni 1998). Par exemple, en faisant battre leurs cils, ces cellules aident à la circulation du LCR (Worthington & Cathcart 1963; Cathcart & Worthington 1964). De ce fait, elles servent à établir un gradient de molécules de guidage qui oriente la migration vers le bulbe olfactif des progéniteurs neuronaux issus de la zone sous-ventriculaire (ZSV) antérieure adulte (Sawamoto et al. 2006). Elles procèderaient aussi à la filtration du LCR (Del Bigio 1995). D’après le laboratoire de Jonas Frisen, certaines cellules épendymaires pourraient également être des cellules souches dans la ZSV adulte (Johansson et al. 1999), une hypothèse très controversée et désormais largement écartée (Chiasson et al. 1999). Les molécules GFAP, vimentine, S100 et kératine font partie des marqueurs retrouvés dans au moins certaines cellules épendymaires mais ces observations varient d’une étude à l’autre, notamment en fonction de l’espèce, de la zone anatomique et du stade de développement analysés (Bruni 1998).

iii. Tanycytes

Intercalées parmi les cellules de l’épendyme se trouvent des cellules différentes par leur morphologie et, sans doute, leur fonction : ce sont les tanycytes. La caractéristique morphologique des tanycytes consiste en un long prolongement basal qui plonge dans le tissu nerveux sous-jacent, où il contacte des vaisseaux sanguins, des neurones ou d’autres cellules gliales (Bruni 1998). Chez les mammifères adultes, la localisation des tanycytes est restreinte à certaines zones, notamment le plancher du quatrième ventricule, l’aqueduc de Sylvius, les organes périventriculaires et les parois latérales du troisième ventricule (Flament-Durand & Brion 1985). Comme les astrocytes, les cellules épendymaires et les tanycytes sont assemblés en un réseau interconnecté par des jonctions communicantes (Jarvis & Andrew 1988). Le rôle des tanycytes, encore méconnu, varie selon la sous-population étudiée et serait lié à différentes fonctions : le maintien d’un certaine forme de barrière entre le LCR et le sang, ou encore la régulation de la sécrétion d’hormones de l’adénohypophyse (Rodriguez et 6

al. 2005). Une particularité intrigante des tanycytes concerne les contacts privilégiés, parfois synaptoïdes, que certains établissent avec des neurones et qui laissent supposer que leur fonction serait sous contrôle de l’activité neuronale (Bruni 1998). De nombreuses molécules ont été décrites comme étant exprimées dans les tanycytes, notamment GFAP, S100, vimentine et RC1, un marqueur de glie radiaire (voir Rodriguez et al. 2005 pour une revue). Il existe cependant plusieurs sous-types de tanycytes de localisation et de morphologie variables et reconnus par différentes combinaisons de marqueurs (Rodriguez et al. 2005).

iv. Glie de l’épiphyse

L’épiphyse constitue une glande endocrine attachée à la partie postérieure du troisième ventricule cérébral et située hors de la barrière hématoméningée. Elle est responsable de la sécrétion de nombreuses hormones telles la mélatonine et la sérotonine, qui interviennent notamment dans la régulation des rythmes biologiques (Nussey & Whitehead 2001). En plus des cellules sécrétrices (les pinéalocytes), cette structure renferme des cellules gliales, dont la fonction serait de réguler la synthèse et la sécrétion d’hormones (Echigo & Moriyama 2004). Elles sont souvent considérées comme des astrocytes parce qu’elles expriment GFAP, S100B et vimentine. Notons que l’expression de ces marqueurs semble hétérogène (Kofler et al. 2002).

v. Glie radiaire

La glie radiaire a surtout été caractérisée au cours du développement. Elle tire son nom de la forme et de la position de ses cellules : allongées, elles ont deux prolongements reliant les surfaces luminale et piale du tube neural. La glie radiaire forme ainsi une sorte d’échafaudage le long duquel les neurones nouvellement formés migrent pour atteindre leur localisation finale dans le SNC (Rakic 1972; Alberts et al. 2002). En fin d’embryogenèse, elle présente aussi des caractéristiques de cellules souches, puisqu’elle génère des astrocytes, des neurones et des oligodendrocytes (voir la section ultérieure sur les types de précurseurs gliaux au cours du développement du SNC). Dans le cerveau mature, la glie radiaire ne subsiste qu’à deux endroits : le cervelet et la rétine. Dans le cervelet, elle prend le nom de « glie de Bergmann » et régule la plasticité synaptique (Muller & Kettenmann 1995). Dans la rétine, les « cellules de Müller » modulent l’environnement cellulaire (Nilius & Reichenbach 1988) et communiquent de façon bidirectionnelle avec les neurones, contribuant ainsi à réguler le traitement de l’information 7

visuelle (Newman 2004). De plus, chez certains vertébrés comme le poulet, la glie de Müller peut également servir de précurseur neuronal et donc participer à la régénération de la rétine (Fischer & Reh 2001). Des marqueurs classiques de la glie radiaire sont RC1 et RC2, mais ils ne sont pas maintenus chez l’adulte (Misson et al. 1988; Edwards et al. 1990). Par contre, on retrouve GFAP, S100B, vimentine et GLAST dans la glie radiaire adulte (Shaw et al. 1981; Bignami 1984; Landry et al. 1989; Muller 1992; Rothstein et al. 1994; Derouiche & Rauen 1995). vi. Glie réactionnelle

Enfin, un dernier type de macroglie n’apparaît dans le SNC qu’après une lésion : c’est la glie réactionnelle. Lors d’une atteinte au SNC provoquée par exemple par une ischémie, des maladies neurodégénératives ou une tumeur, on observe localement des astrocytes hypertrophiés, qui prolifèrent (on parle alors de « gliose réactionnelle ») et expriment des niveaux importants de plusieurs marqueurs astrocytaires, notamment GFAP (Eng et al. 2000). La cicatrice gliale qui en résulte est souvent considérée comme un obstacle à la repousse axonique mais pourrait en fait avoir pour fonction de circonscrire la zone lésée pour éviter que les dommages se propagent (Kimelberg 2004; Pekny & Nilsson 2005). Le tableau 1 ci-après résume les principales caractéristiques de chaque type de macroglie du SNC adulte, en incluant les cellules NG2+ décrites plus tard, dans la section sur la gliogenèse adulte.

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Tableau 1 : Les types de cellules macrogliales du SNC adulte Nom

Morphologie

Distribution

Fonction

Astrocytes

Etoilée. Protoplasmiques : prolongements courts, épais et très branchés. Fibreux : prolongements longs et fins Petites cellules, prolongements entourant les axones Variée. Prolongements.

Uniforme dans tout le SNC (protoplasmiques : matière grise; fibreux : matière blanche)

Barrière hématoméningée, régulation de l’environnement chimique, modulation des synapses…

Préférentielle dans la matière blanche

Myélinisation

Neurohypophyse

Modulation de la neurosécrétion ?

Cellules épendymaires

Variée, souvent ciliée. Forment une monocouche.

Tanycytes

Long prolongement basal

Barrière entre le SNC et le LCR, circulation et filtration du LCR, guidage des précurseurs neuronaux de la ZSV Méconnue : lien entre le LCR et le sang, régulation de la sécrétion d’hormones

Glie de l’épiphyse

Etoilée

Parois des ventricules cérébraux et du canal central de la moelle épinière Intercalée parmi les cellules épendymaires, dans des zones restreintes du SNC Epiphyse

Glie de Bergmann

Radiaire

Cervelet

Glie de Müller

Radiaire

Rétine

Glie réactionnelle

Hypertrophiée

Glie NG2+

2 types : soit uni- ou bipolaire, soit multipolaire et très ramifiée

Oligodendrocytes Pituicytes

Régulation de la synthèse et de la sécrétion de mélatonine Régulation de la plasticité synaptique

Modulation de l’environnement cellulaire, communication avec les neurones Au site d’une lésion Circonscription de la lésion Uniforme dans tout le SNC

Méconnue : genèse d’oligodendrocytes, de neurones, de la glie réactionnelle, mise en place et stabilisation des synapses et des nœuds de Ranvier…

Exemples de marqueurs GFAP, GLAST, GLT-1, GS, S100B

CNP, MAG, MBP, MOG, Olig1/2, PLP, Sox10 GFAP, PSANCAM, S100B, vimentine GFAP, kératine, S100B, vimentine GFAP, RC1, S100, vimentine GFAP, S100B, vimentine GFAP, GLAST, S100B, vimentine GFAP, GLAST, S100B, vimentine GFAP, S100B, vimentine NG2, PDGFRα, Olig1/2

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II. Le développement des cellules gliales du SNC Une question particulièrement étudiée ces dernières années concerne l’origine de la glie et les relations de lignage qui lient les différents types de cellules gliales.

1. La spécification des cellules gliales Au cours du développement, les principaux types de cellules neurales apparaissent séquentiellement chez l’embryon (Figure 1) : d’abord les neurones, puis les astrocytes, et enfin les oligodendrocytes, dont la maturation persiste après la naissance (Sauvageot & Stiles 2002). Figure 1 : Le décours temporel des phases de neurogenèse, d’astrogenèse et d’oligodendrogenèse

Au cours du développement du cerveau, la formation des trois principaux types cellulaires se déroule séquentiellement selon trois phases partiellement chevauchantes dans le temps. Dans le cerveau antérieur de rat, la neurogenèse connaît un pic au 14e jour de gestation (E14), l’astrogenèse au deuxième jour postnatal (P2), et l’oligodendrogenèse à P14. Tiré de Sauvageot & Stiles 2002 Cependant, même si les cellules gliales apparaissent tardivement, il est désormais établi que leur identité est déterminée bien plus tôt d’après la position de leurs précurseurs au sein du tube neural.

a. La neurulation et le développement du tube neural Après la gastrulation, où se forment les trois feuillets embryonnaires (endoderme, mésoderme et ectoderme), le système nerveux se met en place au cours d’une étape du développement appelée « neurulation ». Chez le rat, elle a lieu à E9 (Ayer-Le Lievre et al. 1995). Sous l’influence de substances inductrices sécrétées par le mésoderme, les cellules ectodermiques sus-jacentes se transforment en cellules neurales. La région dorsale de

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l'ectoderme s'épaissit alors pour former la plaque neurale, qui se referme ensuite en gouttière puis en un tube détaché de l'ectoderme : c’est le tube neural (Figure 2) (Gilbert 2000).

Figure 2 : Formation du tube neural chez les vertébrés.

De manière simplifiée, la formation du tube neural est ici présentée en trois étapes. A. Le mésoderme (Msd) induit dans l’ectoderme (Ecd) sus-jacent la spécification de la plaque neurale (PN). B. La plaque neurale s’invagine et prend la forme d’une gouttière (G) tandis que la notochorde (Nc) apparaît ventralement dans le mésoderme. C. La gouttière se referme en un tube, le tube neural (TN). S : somites; CN : crête neurale Tiré de Bongarzone 2002 Par la suite, la partie antérieure du tube neural présente un renflement qui correspond au futur encéphale. Progressivement, cette vésicule se subdivise, ce qui mène à la formation de trois, puis cinq vésicules. Chacune donne naissance à des structures bien précises du SNC. La figure 3 illustre ces divisions du tube neural et les dérivés du futur SNC qu’elles génèrent (Gilbert 2000). Figure 3 : Les vésicules du tube neural et leurs structures dérivées chez l’adulte

Dans sa partie antérieure, le tube neural des vertébrés est d’abord subdivisé en trois vésicules primaires, puis en cinq vésicules secondaires. Chez les mammifères, ces vésicules génèrent ensuite les structures indiquées à droite. Tiré de Gilbert 2000 11

b. Mécanismes moléculaires de l’établissement des axes antéropostérieur et dorsoventral du tube neural Des mécanismes moléculaires complexes contrôlent le développement du tube neural, tant au niveau de l'induction que de la prolifération, de la migration et de la différenciation cellulaires. En particulier, ces différents processus dépendent de signaux moléculaires qui proviennent notamment des tissus adjacents et qui façonnent la polarité antéropostérieure et dorsoventrale du tube neural. C’est en effet la position d’une cellule dans le tube qui détermine son identité.

i. Polarité antéropostérieure

L’expression des gènes Hox, qui contrôlent l’établissement de l’axe antéropostérieur dans tout l’organisme, régule aussi l’identité cellulaire dans le cerveau postérieur et la moelle épinière. La formation des vésicules neurales le long de l’axe antéropostérieur implique également les Fibroblast Growth Factors (FGF), Wnt, engrailed et l’acide rétinoïque, en provenance du mésoderme voisin et de l’organisateur isthmique (région antérieure à la constriction qui sépare les vésicules mésencéphalique et rhombencéphalique). Au niveau du prosencéphale, c'est la plaque préchordale qui joue le rôle d'inducteur avec l'expression de facteurs de transcription tels que Emx, Lim et Otx (Altmann & Brivanlou 2001 et site www.embryology.ch).

Figure 4 : Induction de l’axe antéropostérieur dans le tube neural.

La régionalisation antéropostérieure du tube neurale résulte de l’effet inducteur de différents signaux en provenance de la plaque préchordale (en bleu), de l’organisateur isthmique (en rouge), de la notochorde (en jaune) et du mésoderme dorsal (en vert). en : engrailed ; M : mésencéphale ; P : prosencéphale ; R, rhombencéphale ; TN : tube neural. Tiré du site www.embryology.ch

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ii. Polarité dorsoventrale

Deux types de molécules ont été identifiées comme des acteurs majeurs de la régionalisation dorsoventrale du tube : Sonic Hedgehog (Shh) et les Bone Morphogenetic Proteins (BMP). Shh, molécule sécrétée par la notochorde puis également par le plancher du tube neural, induit la spécification des types cellulaires ventraux. En effet, différentes concentrations de Shh induiraient l’expression de facteurs de transcription, qui, par des répressions mutuelles, établissent une succession de domaines ventraux. Dans chaque domaine se développent un ou plusieurs sous-types spécifiques de progéniteurs neuronaux, par exemple les motoneurones dans le domaine pMN de la moelle. De la même manière, du côté dorsal, les BMP du toit du tube neural sont responsables de la formation de domaines d’expression de facteurs de transcription qui définissent l’identité des types cellulaires dorsaux (Bongarzone 2002; Wilson & Maden 2005). Figure 5 : Induction de domaines de spécification des progéniteurs neuraux par l’expression dorsale des BMP et ventrale de Shh dans la moelle épinière

A. La sécrétion ventrale de Shh et celle, dorsale, de BMP et d’autres molécules dorsalisantes (dorsaline, activine) mènent à la formation de deux gradients contraires de morphogènes. Ces gradients induisent la création d’une série de domaines de spécification des cellules neurales. B. Ces domaines de spécification sont définis par l’expression de différents facteurs de transcription (à gauche sont présentés certains facteurs exprimés chez la souris). Les pointillés indiquent que les frontières de ces domaines changent au cours du développement. Par exemple, l’expression de Nkx2.2 s’étend dorsalement. Dans chacun de ces domaines sont spécifiés des types de neurones différents, notamment les motoneurones dans le pMN. dP1–dP6 : domaines dorsaux; pMN et p0–p3 : domaines ventraux. Tiré de Gilbert 2000 et Richardson et al. 2006 13

c. Zones de spécification gliale dans le tube neural Comme pour les neurones, l’identité des cellules gliales est régie par leur position dans le tube neural. Ainsi, les oligodendrocytes ne naissent que dans des régions bien précises du tube. En effet, l’expression de marqueurs du lignage oligodendrocytaire comme pdgfrα et plp/dm20 est d’abord restreinte à quelques zones focales de la moelle et du cerveau (Figure 6), puis s’étend à tout le tube neural au fur et à mesure que les cellules qui les expriment migrent dans le SNC. Figure 6 : Représentation schématique du patron d’expression de plp/dm20 dans l’embryon de souris à E12,5.

Chez l’embryon de souris, plp/dm20 est exprimé dans des territoires (en rouge) très restreints et discontinus le long de l’axe antéropostérieur. En particulier, ces transcrits sont détectés dans l’aire entopédonculaire (aep), le diencéphale (notamment dans la zona limitans intrathalamica (zli)), les rhombomères r1, r2, r6 et r7 et dans deux colonnes continues dans la moelle épinière (non montré), mais pas dans le mésencéphale (més) ni dans les rhombomères r3 à r5. p(n): prosomère; r(n): rhombomère Tiré de Spassky et al. 2000 De plus, dans l’axe dorsoventral, la formation initiale des oligodendrocytes nécessite l’action de Shh et a donc lieu dans des domaines de spécification ventraux. Par exemple, dans la moelle, les précurseurs d’oligodendrocytes proviennent d’abord du domaine ventral de détermination des motoneurones (pMN) et, dans le télencéphale, de régions ventrales comme l’éminence ganglionnaire médiane (Figure 7). Ces précurseurs migrent ensuite dorsalement et latéralement avant de se différencier en oligodendrocytes. Des travaux récents ont également montré qu’une seconde vague d’oligodendrocytes naît dans la partie dorsale de la moelle vers E13,5-E15 chez la souris (Cai et al. 2005; Vallstedt et al. 2005).

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Figure 7 : Origine restreinte des précurseurs d’oligodendrocytes dans le tube neural ventral de souris à E12,5

Chez la souris, les précurseurs d’oligodendrocytes (points bleus) émergent vers E12,5 dans des zones ventrales du tube neural, tels le domaine pMN dans la moelle épinière (A) et l’éminence ganglionnaire médiane et l’aire entopédonculaire dans le télencéphale (B). Tiré de Rowitch 2004 La spécification des astrocytes a été moins étudiée, notamment faute de marqueur précoce de leur lignage. Toutefois, des études génétiques semblent indiquer que ces cellules sont générées tout le long de l’axe antéropostérieur du tube neural mais dans des zones restreintes selon l’axe dorsoventral. Il s’agit de régions distinctes des zones de spécification des oligodendrocytes, à savoir le domaine ventral p2 dans la moelle et un domaine dorsal dans le télencéphale (Zhou 2003; Rowitch 2004; Muroyama et al. 2005). Figure 8 : Spécification des précurseurs d’oligodendrocytes et d’astrocytes dans des régions distinctes du tube neural

Avant de migrer hors de la zone ventriculaire, les précurseurs d’oligodendrocytes et d’astrocytes sont sans doute spécifiés dans des domaines distincts du tube neural. A. Chez les rongeurs, les oligodendrocytes émergent en effet du domaine pMN de la moelle épinière alors que les astrocytes seraient spécifiés dans le domaine p2 plus dorsal. B. Dans le télencéphale, les astrocytes naîtraient dans une région dorsale où sont générés les neurones pyramidaux tandis que les précurseurs d’oligodendrocytes émaneraient essentiellement de régions ventrales comme les éminences ganglionnaires médiane (EGM) et latérale (EGL), c’est-à-dire près d’une source de Sonic hedgehog (Shh). BMP : Bone Morphogenetic Proteins Tiré de Rowitch 2004 15

2. Les différents types de précurseurs gliaux du SNC Plusieurs types de cellules souches ou progénitrices présentes dans le SNC en développement ont été identifiés comme étant capables de générer des cellules gliales. Avant de présenter leurs différentes propriétés, la nécessité de définir les cellules souches et progénitrices s’impose, ainsi qu’un bref exposé des techniques utilisées pour leur caractérisation et l’établissement de leur lignage.

a. Définition des cellules souches et précurseurs neuraux Le terme « cellules souches neurales » ne s’applique qu’aux cellules qui possèdent les cinq propriétés suivantes (Reynolds & Weiss 1996) : 1) elles sont prolifératives, même si leur cycle de division peut être relativement long ; 2) elles ont la capacité de s’auto-renouveler, c’est-à-dire qu’elles peuvent produire des cellules filles identiques à la cellule mère et ce, indéfiniment. Cela implique que la population de cellules souches ait la capacité de se diviser de façon asymétrique, afin de générer des progéniteurs engagés vers une voie de différenciation tout en maintenant un réservoir de cellules souches indifférenciées. 3) elles sont multipotentes, autrement dit capables de générer des cellules différenciées des trois principaux types cellulaires du SNC (neurones, astrocytes, oligodendrocytes) ; 4) elles maintiennent cette multipotentialité au cours du temps ; 5) elles doivent en principe permettre la restauration du tissu nerveux après une lésion. Cependant, cette propriété est rarement utilisée pour définir une cellule souche. On parle plutôt de « précurseur multipotent » quand une cellule a la possibilité de se différencier en au moins deux lignages différents mais possède une capacité à s’autorenouveler limitée. Il existe aussi des précurseurs engagés dans un lignage donné, par exemple des précurseurs d’astrocytes ou des précurseurs d’oligodendrocytes. J’utiliserai ici indifféremment les termes « précurseur » et « progéniteur ».

b. Techniques d’identification des cellules souches et précurseurs neuraux L’identification de cellules souches résulte généralement d’une combinaison de tests fonctionnels in vivo et in vitro (Noble et al. 2004; Ming & Song 2005). Premièrement, l’étude de la prolifération de ces cellules peut se faire in vivo, grâce à des marqueurs de cellules en division. Pour les repérer, on injecte ou on fait ingérer à l’animal des agents intercalants qui s’intègrent dans l’ADN au cours d’un cycle cellulaire. Typiquement, il s’agit de la thymidine marquée radioactivement ou de ses analogues -le plus 16

courant étant la bromodésoxyuridine (BrdU)- que l’on détecte par autoradiographie ou immunocytochimie. Des marqueurs spécifiques de certaines phases du cycle cellulaire (PCNA, Ki67, phospho-histone H3) ont également été découverts et servent à identifier les cellules non quiescentes (Miyachi et al. 1978; Gerdes et al. 1984; Celis et al. 1986; Bacchi & Gown 1993). En ce qui concerne la capacité de différenciation des cellules souches ou progénitrices, elle est souvent analysée in vitro. Les cellules sont pour cela dissociées, puis parfois sélectionnées, par exemple sur un gradient de centrifugation, par sélection par le milieu de culture, ou par tri cellulaire magnétique (MACS) ou à fluorescence (FACS). Après la mise en culture, on détermine le phénotype des cellules qu’elles génèrent d’après leur morphologie, l’expression de marqueurs ou encore par analyse de leurs propriétés électrophysiologiques. Des transplantations peuvent aussi servir à démasquer le potentiel de différenciation des cellules. Cependant, si les potentiels de différenciation ainsi mis en évidence in vitro ou après transplantation révèlent la capacité d’une cellule donnée à générer telle ou telle cellule mature dans ces conditions, ils ne permettent pas de savoir si cette cellule se différencie effectivement dans ces types cellulaires in vivo dans son environnement naturel. Ensuite, l’auto-renouvellement des cellules souches et des précurseurs est le plus fréquemment déterminé in vitro. En particulier, les cellules souches dissociées et maintenues en cultures flottantes constituent des structures en forme de boules, des « neurosphères », au fur et à mesure qu’elles se divisent en réponse à l’Epidermal Growth Factor (EGF) et/ou au FGF-2 (Reynolds & Weiss 1992). La capacité à former des neurosphères en tant que telle ne démontre pas l’existence de cellules souches, simplement la présence de cellules en division. En fait, les neurosphères sont composées d’une proportion de cellules souches souvent faible, le reste étant des précurseurs aux potentiels de prolifération et de différenciation plus ou moins restreints. Pour démontrer qu’un tissu contient des cellules souches capables de s’autorenouveler, une analyse clonale est nécessaire : les neurosphères dites primaires sont alors dissociées et remises en culture et, dans ces conditions, seules les cellules souches survivent pour former à nouveau des neurosphères, dites secondaires. Après transfert dans des conditions adéquates, on vérifie que ces neurosphères secondaires se différencient en cellules des trois lignages neuraux (neuronal, astrocytaire et oligodendrocytaire). Ces expériences sont ensuite répétées sur plusieurs générations de sphères, ce qui permet d’établir que les cellules conservent leur capacité à s’auto-renouveler et maintiennent leur multipotentialité au cours du temps (Figure 9).

17

Figure 9 : Principe d’analyse clonale de neurosphères pour mettre en évidence la présence de cellules souches neurales

1. Après dissociation, les cellules du tissu nerveux sont cultivées en présence d’EGF. Les cellules souches neurales survivent et prolifèrent pour former des clones de cellules non différenciées flottant dans le milieu, les neurosphères primaires. 2. Sur un support permettant leur adhésion, les cellules composant les neurosphères se différencient pour générer les trois types cellulaires majeurs du système nerveux central: neurones, astrocytes et oligodendrocytes. 3. En cultivant les cellules composant les neurosphères en condition clonale (1 cellule par puits), seule une minorité des cellules forme de nouvelles neurosphères (dites secondaires) capables de se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes. Ces cellules sélectionnées par l’EGF, capables d’auto-renouvellement et multipotentes sont des cellules souches neurales. 4. Si les neurosphères primaires contiennent effectivement des cellules souches, alors après dissociation et mise en culture dans un seul puits, elles doivent aussi pouvoir donner naissance à des neurosphères secondaires, elles aussi multipotentes, et ainsi de suite pendant de nombreux passages. Cela montre que les propriétés des cellules souches sont maintenues au fil du temps. Tiré de Bouissac 2005, adapté de Reynolds & Weiss 1996 Pour terminer, je mentionnerai que plusieurs marqueurs de précurseurs gliaux ont été identifiés (voir plus bas) mais qu’on ne connaît pas de marqueur universel de cellules souches 18

neurales, qui faciliterait grandement leur étude. Malgré tout, certains auteurs ont identifié des cellules immatures qu’ils ont souvent qualifiées de cellules souches neurales grâce à l’expression de nestine (Lendahl et al. 1990; Yamaguchi et al. 2000), Sox2 (D'Amour & Gage 2003; Ferri et al. 2004; Episkopou 2005), Musashi-1 (Kaneko et al. 2000), ssea1/LeX (Capela & Temple 2002) ou bien GFAP (Doetsch et al. 1999). Cependant, ces marqueurs n’ont sans doute qu’une spécificité partielle, reconnaissant plutôt des sous-types de cellules souches ou progénitrices (Emsley et al. 2005). Par ailleurs, une technique d’isolement des cellules souches consiste à utiliser le marqueur nucléaire Hoechst 33342 : les cellules souches ont tendance à l’exclure par le biais d’un transporteur membranaire et sont donc reconnaissables à leur profil de fluorescence particulier lorsqu’elles sont triées par FACS (Hulspas & Quesenberry 2000; Engstrom et al. 2002; Bhattacharya et al. 2003; Kim & Morshead 2003).

c. Caractéristiques des différents types de cellules souches et de précurseurs gliaux Les techniques détaillées ci-dessus ont permis d’identifier et de caractériser plusieurs types de cellules souches et de précurseurs neuraux qui génèrent des cellules gliales au cours du développement du SNC. Leurs propriétés caractéristiques sont décrites ici et récapitulées plus bas dans le tableau 3. Il est important de souligner que cette liste n’est en rien exhaustive ni applicable directement à tout le SNC. Certaines régions, notamment la moelle épinière et le cortex cérébral, ont été plus étudiées. On présume souvent que le développement des autres régions leur est en grande partie similaire (Rao 2004a) mais c’est probablement incorrect : il est tout à fait probable qu’il existe de nombreuses particularités locales. De plus, chaque étude présente rarement toute la batterie des tests exposés plus haut. Ainsi, un progéniteur n’a peutêtre pas été trouvé in vivo, ou bien on ne connaît pas entièrement son potentiel de différenciation. Bref, les données sur chaque précurseur sont souvent parcellaires. Ce n’est que petit à petit qu’elles permettront d’obtenir une représentation complète des différents progéniteurs gliaux. Avant tout, comme certaines de ces études ont été faites chez la souris et d’autres chez le rat, je précise dans le tableau 2 la correspondance entre les stades de développement embryonnaire chez ces deux espèces. Tableau 2 : Correspondance entre les stades de la seconde moitié du développement embryonnaire chez la souris et le rat Souris E… Rat

9

9,5

10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 18,5

E… 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 20

Tiré du site http://embryology.med.unsw.edu.au/OtherEmb/Rat.htm 19

i. Cellules neuroépithéliales (NEP)

Lors de la formation du SNC, le tube neural précoce se présente comme une monocouche de cellules en prolifération appelées précurseurs neuroépithéliaux (NEP, pour NeuroEpithelial Precursors). Chez l’embryon de rat1 à 10,5 jours de gestation (E10,5), elles constituent l’essentiel du tube. Ce sont des cellules souches multipotentes (Davis & Temple 1994; Kalyani et al. 1997; Cai et al. 2002) qui dépendent du FGF in vitro (Kalyani et al. 1997). Elles expriment des marqueurs tels nestine, Musashi-1, Sox2 et sont immunonégatives pour PSA-NCAM, A2B5, GFAP et d’autres marqueurs de cellules différenciées (Kaneko et al. 2000; Rao 2004a). Bien que les NEP semblent tous identiques dans leur capacité à proliférer et dans leur multipotentialité, ils présentent une certaine régionalisation en termes de potentiel de migration et d’expression de certains marqueurs (Hitoshi et al. 2002). Avec l’âge, la proportion de NEP diminue à mesure qu’augmente celle des progéniteurs plus restreints (Levison & Goldman 1997). Ainsi, à E14,5, les NEP ne représentent plus que 10% des cellules du tube neural, comme l’indiquent des études d’expression de marqueurs et des analyses clonales (Kalyani et al. 1997; Mayer-Proschel et al. 1997; Rao 2004a). Les autres cellules du tube neural sont alors des précurseurs neuronaux (NRP, pour Neuronal Restricted Precursors) et gliaux (cellules de la glie radiaire et GRP, pour Glial Restricted Precursors) (Mayer-Proschel et al. 1997; Kalyani et al. 1998; Rao et al. 1998).

ii. Précurseurs restreints au lignage glial (Glial Restricted Precursors ou GRP)

Dès E12, des cellules progénitrices engagées vers une destinée gliale peuvent être isolées du tube neural de rat, à tous les niveaux rostrocaudaux : ce sont les GRP (Rao et al. 1998; Gregori et al. 2002; Rao 2004a). In vitro et in vivo après transplantation, les GRP peuvent donner naissance à des oligodendrocytes et à deux types d’astrocytes (de types 1 et 2), mais pas à des neurones (Rao et al. 1998; Herrera et al. 2001). Les astrocytes de type 1 ont une morphologie aplatie en culture et expriment S100B et GFAP mais pas l’antigène d’A2B5, alors que les astrocytes de type 2, de forme étoilée, sont aussi GFAP+ mais également A2B5+ et parfois O4+ (Raff et al. 1983a; Ingraham et al. 1999). On reconnaît les GRP à leur expression de l’antigène d’A2B5 et de nestine. D’autres marqueurs semblent définir deux sous-types de GRP, présents dans des domaines distincts de la moelle embryonnaire : le premier exprimant Olig1, Olig2 et Sox10, le second dm20, Ngn3, Nkx2.2 et Sox2 (Liu et al.

1

A moins d’indication contraire, les âges correspondent au développement chez le rat.

20

2002). Par contre, les GRP n’expriment initialement pas PDGFRα, le récepteur α du PlateletDerived Growth Factor-AA (PDGF-AA) (Rao 2004a).

iii. Glie radiaire

Quand les NEP commencent à générer des précurseurs neuraux, ceux-ci migrent hors de la zone ventriculaire (centrale) du tube neural et forment ce qu’on appelle la zone du manteau, autour de la zone ventriculaire où subsistent les NEP. C’est dans ce manteau que débute la différenciation des neurones et de la glie radiaire, cette dernière servant de guide pour la migration des neurones nouvellement formés (Rakic 1972). Traditionnellement, les cellules de la glie radiaire sont considérées comme les premières cellules gliales différenciées qui peuvent être distinguées dans le tube neural. Cependant, le rôle des cellules de la glie radiaire comme précurseurs d’astrocytes, de neurones, d’oligodendrocytes et de cellules épendymaires est désormais établi (Schmechel & Rakic 1979; Levitt & Rakic 1980; Choi & Kim 1985; Hirano & Goldman 1988; Voigt 1989; Malatesta et al. 2000; Miyata et al. 2001; Noctor et al. 2001; Fogarty et al. 2005; Spassky et al. 2005). Il semblerait qu’elles soient aussi à l’origine des cellules souches du SNC adulte (Merkle et al. 2004). Des marqueurs fréquemment utilisés pour détecter la glie radiaire sont RC1 et RC2, GLAST, nestine, vimentine et zébrine-2 (Shibata et al. 1997; Goldman 2004), RC1 étant par exemple présent à partir de E13,5 dans le tube neural de rat (Liu et al. 2002). Il existe cependant des variations dans l’expression de ces marqueurs dans la glie radiaire, ce qui suggère qu’elle serait plus hétérogène qu’on ne le supposait (Campbell & Gotz 2002).

iv. Cellules souches sensibles à l’EGF

Une autre population de cellules fait son apparition à partir de E14 chez la souris (donc vers E15,5 chez le rat), soit juste après la différenciation de la glie radiaire et des premiers neurones, et avant l’expression de marqueurs gliaux comme NG2 ou GFAP : il s’agit des cellules souches dépendantes de l’EGF (Reynolds et al. 1992; Morshead et al. 1994), alors que nous avons vu que les NEP ont une dépendance trophique au FGF (Kalyani et al. 1997; Rao 2004a). Probablement situées dans la zone sous-ventriculaire (ZSV), elles sont multipotentes in vitro, où elles peuvent former des neurosphères. Cependant, contrairement aux NEP, elles semblent perdre cette multipotentialité au fil de leurs divisions, du moins en cultures de neurosphères (Rao 2004b). Les cellules souches sensibles à l’EGF représentent 1-3% des cellules du SNC de souris à E14 (Reynolds & Weiss 1996). A ma connaissance, seuls les récepteurs de l’EGF pourraient servir de marqueur pour les distinguer 21

des NEP, avec lesquelles elles coexistent. Ces deux types de cellules souches peuvent contribuer à la gliogenèse mais leur participation respective réelle est difficile à estimer (Rao 2004a). v. Progéniteurs O-2A/OPC

Historiquement, le précurseur glial caractérisé le premier fut le progéniteur O-2A, ainsi baptisé parce qu’il génère en culture des oligodendrocytes et des astrocytes de type 2 (Raff et al. 1983b). Comme il n’a jamais été clairement démontré que les progéniteurs O-2A donnent naissance à des astrocytes in vivo au cours du développement normal (Skoff 1990; Fulton et al. 1991; Fulton et al. 1992; Espinosa de los Monteros et al. 1993; Franklin & Blakemore 1995), les progéniteurs O-2A sont désormais appelés précurseurs d’oligodendrocytes ou OPC (Oligodendrocyte Precursor Cells). Ces cellules ont été abondamment caractérisées in vitro, notamment à partir de nerf optique périnatal. Par exemple, de nombreuses études ont montré la dépendance des OPC visà-vis-de différents facteurs (voir Miller 2002 pour une revue). Notamment, le FGF-2, le PDGF-AA et la neurotrophine-3 (NT3) sont importants dans la régulation de leur croissance, leur survie et leur migration (Noble et al. 1988; Richardson et al. 1988; Armstrong et al. 1990; Bogler et al. 1990; McKinnon et al. 1990; Noble et al. 1990; Barres et al. 1993; Barres et al. 1994). Mentionnons aussi les travaux de Kondo et Raff, qui ont démontré que des OPC maintenus en culture peuvent générer des astrocytes de type 2, qui à leur tour donnent naissance à des cellules souches neurales (Kondo & Raff 2000). Les cultures d’OPC ont également permis de définir des marqueurs caractéristiques des OPC, notamment PDGFRα (Hall et al. 1996) et le protéoglycane NG2 (Nishiyama et al. 1996b), ainsi que l’antigène de surface reconnu in vitro par l’anticorps A2B5 (Raff et al. 1983b). D’autres marqueurs de l’ensemble du lignage oligodendrocytaire se retrouvent dans les OPC : Sox10, un facteur de transcription essentiel à la différenciation terminale des oligodendrocytes (Kuhlbrodt et al. 1998; Zhou et al. 2000), Olig1 et Olig2, deux facteurs de transcription de la famille bHLH nécessaires à l’engagement des OPC et à la spécification du lignage oligodendrocytaire (Lu et al. 2000; Zhou et al. 2000), et les transcrits plp/dm20 et cnp des protéines PLP et CNP (Yu et al. 1994; Spassky et al. 1998), des composants de la myéline. In vivo, il n’est souvent pas aisé de déterminer si les cellules qui expriment ces marqueurs sont des OPC ou bien des GRP, dont l’existence n’a été mise en évidence que bien plus tard, ou encore d’autres types de précurseurs non identifiés. Seule l’expression de pdgfrα serait caractéristique des OPC, les GRP ne l’exprimant qu’après un certain temps en culture 22

(Noble et al. 2004; Rao 2004a). Comme pdgfrα n’apparaît que vers E13 dans la moelle épinière de rat (Pringle & Richardson 1993; Hall et al. 1996), on suppose que l’expression plus précoce d’autres marqueurs (Olig1, Olig2, plp/dm20, sox10) pourrait en fait correspondre aux GRP ou même à d’autres précurseurs neuraux qu’il reste à caractériser (Timsit et al. 1995; Lu et al. 2000; Zhou et al. 2000; Liu et al. 2002). Notons qu’un autre problème vient compliquer la question : tous les OPC ne semblent pas identiques : des sous-populations peuvent être distinguées par leur expression soit de plp/dm20, soit de pdgfrα (Spassky et al. 1998). Les OPC plp/dm20+ ne sont probablement pas des GRP puisque des cellules GFP+ isolées à partir de diencéphale de souris plp-GFP à E9,5-E10,5 ne peuvent pas générer d’astrocytes (Le Bras et al. 2005). Bref, la caractérisation comparée des GRP et des OPC in vivo demeure incomplète. Il faut donc se méfier du terme de « progéniteur d’oligodendrocyte », trop fréquemment employé pour désigner in vivo toute cellule immature exprimant des marqueurs précoces du lignage oligodendrocytaire. vi. Précurseurs d’astrocytes (Astrocyte Precursor Cells ou APC)

De la même façon que les OPC ont un potentiel de différenciation restreint au lignage oligodendrocytaire, il existerait des cellules qui ne génèrent que des astrocytes. De tels précurseurs d’astrocytes (APC, pour Astrocyte Precursor Cells) ont été isolés à partir d’une lignée dérivée de cervelet de souris à E16 (Seidman et al. 1997). Ils n’expriment ni A2B5, ni GFAP et sont sensibles à l’EGF mais pas au PDGF (Pringle et al. 1992; Seidman et al. 1997). En culture, ils se différencient en astrocytes de type 1 GFAP+ mais pas en oligodendrocytes (Seidman et al. 1997). Des cellules semblables, mais marquées par l’anticorps A2B5, ont par ailleurs été identifiées dans des cultures de moelle épinière de rat nouveau-né et dans le nerf optique de rat embryonnaire ou néonatal (Fok-Seang & Miller 1992; Mi & Barres 1999). D’autres marqueurs d’APC seraient CD44, fgfr3, nestine, vimentine et Pax2 (Mi & Barres 1999; Pringle et al. 2003; Liu et al. 2004). Il n’a pas été clairement établi si le marqueur S100B, exprimé dans les astrocytes matures, est également retrouvé dans les APC (Mi & Barres 1999; Liu et al. 2004). Des études tentent à présent de combiner des techniques de culture et de marquages in situ afin d’identifier in vivo les APC caractérisés in vitro (voir par exemple Pringle et al. 2003 ou Liu et al. 2004).

vii. Précurseurs de motoneurones et d’oligodendrocytes (Motor Neuron-Oligodendrocyte Precursors ou MNOP)

Enfin, des travaux sur la moelle épinière ont suggéré que le développement des oligodendrocytes serait plus lié à celui des motoneurones qu’à celui des astrocytes. 23

Premièrement, les oligodendrocytes et les motoneurones naissent dans la même zone focale de la moelle ventrale (Richardson et al. 1997; Richardson et al. 2000). Deuxièmement, en culture, ces deux types cellulaires peuvent être obtenus après induction par des concentrations similaires de la protéine Sonic hedgehog (Shh) (Pringle et al. 1996; Orentas et al. 1999). Troisièmement, la genèse des motoneurones et celle des oligodendrocytes sont toutes deux perturbées chez des souris mutantes pour les gènes Olig (Lu et al. 2002; Takebayashi et al. 2002; Zhou & Anderson 2002). A partir de ces observations, certains auteurs ont émis l’hypothèse qu’il existe vers E10,5 chez la souris des précurseurs communs aux motoneurones et aux oligodendrocytes (MNOP, pour Motor Neuron-Oligodendrocyte Precursors) (Lu et al. 2002; Takebayashi et al. 2002; Zhou & Anderson 2002). Toutefois, il est aussi possible que différentes sous-populations de précurseurs Olig+ génèrent d’une part les oligodendrocytes et, d’autre part, les motoneurones. Bref, dans une revue sur le sujet, Noble, Pröschel et Mayer-Pröschel concluaient que l’hypothèse des MNOP avait besoin d’être étayée plus solidement (Noble et al. 2004). Depuis, des travaux sont venus remettre encore davantage en doute l’existence des MNOP : en procédant à l’ablation des cellules olig1+ in vivo grâce à l’expression conditionnelle de la toxine diphtérique, Wu et ses collaborateurs

ont

constaté

que

des

progéniteurs

olig1+

de

motoneurones

et

d’oligodendrocytes sont générés au même endroit, mais de façon successive et indépendante (Wu et al. 2006). Pour cette raison, les MNOP n’apparaissent pas dans le tableau 3 cidessous, qui résume les caractéristiques principales des types de cellules dont le rôle de progéniteurs gliaux a été établi. Par ailleurs, certaines études suggèrent un lien étroit entre les oligodendrocytes et d’autres types de neurones. Par exemple, des progéniteurs GFP+ isolés à partir de plaque basale diencéphalique de souris plp-GFP à E9,5-E10,5 peuvent en culture donner naissance à des oligodendrocytes et à des neurones, mais pas à des astrocytes (Le Bras et al. 2005). Il serait intéressant de confirmer ces résultats in vivo pour établir s’il existe réellement un lignage commun pour les oligodendrocytes et certains neurones.

24

Tableau 3 : Types de cellules souches et précurseurs générant de la glie au cours du développement du SNC de rongeur Nom

Age et site d’isolement

Pot. de diff. *

Marqueurs présents

Marqueurs absents

NEP

Tube neural de rat E10,5 (zone ventriculaire)

A, N, O

FGFR, Musashi-1, nestine, Sox2

GRP

Moelle embryonnaire (surtout ventrale) dès E12 chez le rat

A1, A2, O

A2B5, FGFR1,2,3, nestine

Marqueurs de cellules différenciées, A2B5, EGFR, GFAP, PDGFRα, PSANCAM Marqueurs de neurones, de cellules myélinisantes, GalC, GFAP, PDGFRα (initialement), S100B

Glie radiaire

Cellules souches sensibles à l’EGF O-2A/OPC

APC

2 sous-groupes : - Olig1/2 et Sox10 - dm20, Ngn3, Nkx2.2 et Sox2 Parfois NG2 et PDGFRα à partir de E14,5 GLAST, nestine, RC1, RC2, S100B, vimentine, zébrine2

Dans le tube neural à partir d’E13,5-E14,5 chez le rat, selon le niveau rostro-caudal Tube neural de rat E14 (ZSV)

A, N, O…

A, N, O

EGFR, FGFR1,2, nestine, Musashi-1, Sox2

Nerf optique, cervelet, cortex cérébral, bulbe rachidien et moelle périnataux

A2, O

A2B5, nestine, FGFR1,2,3, PDGFRα, plp/dm20, PSANCAM, NG2, Nkx2.2, Olig1/2, sox10, cnp

A Cervelet de souris à E16, nerf optique en développement, moelle dorsale embryonnaire

Dépendance trophique FGF

FGF-2

GFAP (exprimé tardivement dans certaines cellules, vers E18 chez le rat), NG2 Marqueurs de cellules différenciées, GFAP, NG2 Marqueurs de neurones, de cellules myélinisantes (MBP, MOG), GalC, GFAP

A2B5 (?), CD44, Marqueurs de fgfr3, nestine, Pax2, neurones, de vimentine cellules myélinisantes, GalC, GFAP, RC1

EGF , FGF

PDGF-AA

FGF-2 et GGF

* Potentiel de différenciation : A, astrocytes; A1, astrocytes de type 1; A2, astrocytes de type 2; N, neurones ; O, oligodendrocytes. GGF : Glial Growth Factor

25

3. Les lignages gliaux au cours du développement du SNC Comme nous venons de le voir, l’ensemble des données sur les différents types de précurseurs reste fragmentaire. Naturellement, les relations de lignage entre ces précurseurs demeurent donc obscures pour la plupart. Après avoir défini ce qu’on entend aujourd’hui par « lignage glial », je détaillerai les techniques qui permettent de l’étudier et quelques relations de lignage qui ont ainsi pu être établies.

a. Définition du lignage glial : modèle de restriction progressive des potentiels Le lignage d’une cellule désigne sa descendance, c’est-à-dire les cellules qu’elle engendre au fil de ses divisions. Il existe deux lignages gliaux principaux, qui correspondent aux deux grands types de cellules gliales : le lignage astrocytaire et le lignage oligodendrocytaire. Comme dans d’autres systèmes, le développement des cellules neurales et notamment gliales s’explique actuellement par un modèle de différenciation progressive : les cellules souches neurales génèreraient des cellules différenciées en passant par une succession de stades de précurseurs intermédiaires dont les potentialités de prolifération et de différenciation seraient de plus en plus restreintes, tel qu’illustré sur la figure 10. Figure 10 : Restriction progressive des potentialités cellulaires au cours d’un lignage

Au fur et à mesure que les cellules d’un lignage avancent vers un stade différencié, leurs potentiels se restreignent en termes de prolifération et de différenciation. Ainsi, les cellules souches sont capables d’un auto-renouvellement quasi-infini et sont multipotentes tandis que les précurseurs sont engagés dans une voie de différenciation et ne peuvent se diviser qu’un nombre limité de fois. Tiré de Bouissac 2005 26

Tel que mentionné dans la section précédente, il existe effectivement des précurseurs gliaux avec différents potentiels plus ou moins restreints. D’après le modèle classique, les cellules souches neurales génèrent d’abord des progéniteurs multipotents, qui eux-mêmes donnent naissance à des précurseurs engagés dans l’un des trois lignages neuraux. Ceux-ci ont la capacité de proliférer mais leur potentiel de différenciation est restreint à un seul type de cellule neurale (oligodendrocyte, astrocyte ou neurone). Cependant, nous verrons que les relations de lignage qui unissent les cellules neurales sont loin d’être toutes établies et présentent certainement une plus grande complexité que ce modèle théorique.

b. Techniques d’analyse des lignages neuraux Pour comprendre le lignage réel des précurseurs neuraux, et non pas leur potentiel démasqué dans des conditions de culture par exemple, il faut observer leur devenir in vivo dans leur environnement naturel. L’analyse histologique permet parfois de mettre en évidence dans une région donnée des types cellulaires dont l’apparence semble correspondre à différentes étapes de maturation d’un même lignage. Par exemple, dans le cortex de souris, les cellules radiaires prédominent jusqu’à E17 puis font peu à peu place à des cellules plus arborisées, dont la forme multipolaire est caractéristique des astrocytes (Misson et al. 1991). Ce genre d’analyse morphologique est à présent complété par l’étude des marqueurs exprimés dans ces souspopulations cellulaires. Ainsi, au cours du développement de la moelle épinière de rat apparaissent d’abord des cellules radiaires immunopositives pour A2B5, le ganglioside GD3 et la vimentine, puis des oligodendrocytes et des astrocytes matures, exprimant respectivement l’anhydrase carbonique et la GFAP (Hirano & Goldman 1988). Cette chronologie d’apparition suggère une relation de lignage entre les précurseurs radiaires et les cellules gliales matures puisqu’elle correspond à ce qui est observé au cours du temps dans des cultures de précurseurs gliaux (voir par exemple Raff et al. 1983, Lubetzki et al. 1991). De plus, on s’attend à ce que deux stades successifs d’un lignage expriment certains marqueurs communs. Par exemple, dans la rétine de lapin entre E26 et P50, on observe d’abord des précurseurs d’oligodendrocytes bipolaires O4+/GalC-/MBP-, puis de plus en plus de pré-oligodendrocytes toujours O4+/GalC-/MBP- mais à la morphologie plus ramifiée. Apparaissent ensuite des oligodendrocytes immatures O4+/GalC+/MBP-, et enfin des oligodendrocytes matures myélinisants O4-/GalC+/MBP+ qui entourent les axones de leurs prolongements (Morcos & Chan-Ling 1997).

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Cependant, ces résultats corrélatifs ne permettent pas de démontrer hors de tout doute l’existence de relations de lignage cellulaire. Pour ce faire, plusieurs techniques ont été élaborées afin de marquer les cellules progénitrices et suivre leur devenir in vivo. L’incorporation de BrdU est largement employée pour marquer l’ADN des cellules en division (Figure 11 A). Un immunomarquage anti-BrdU permet ensuite d’identifier ces cellules, du moins si elles ne se divisent pas à nouveau, auquel cas la BrdU serait diluée parmi les cellules-filles. On peut aussi ne marquer qu’une partie des cellules en division en les infectant au moyen d’un rétrovirus incapable de se répliquer et comportant un gène rapporteur (Figure 11 B) : si le virus est suffisamment dilué, on peut supposer que toutes les cellules d’un groupe marqué dans une même zone (un « clone ») descendent d’un seul précurseur (voir par exemple Noctor et al. 2001). De nos jours, il est également possible chez la souris de marquer génétiquement une population de cellules qui expriment un gène donné et de suivre sa différenciation in vivo au cours du temps (Figure 11 C). En particulier, il est très avantageux de créer des souris chez lesquelles l’expression d’un gène rapporteur (souvent celui de la β-galactosidase ou de la GFP) peut être irréversiblement activée dans une population cellulaire donnée grâce à l’utilisation du système Cre-loxP (Mao et al. 2001, voir la section Résultats). Quelle que soit la technique utilisée, on identifie alors les cellules marquées par microscopie électronique, immunomarquage ou hybridation in situ. Dans le cas des marquages par rétrovirus ou par transgenèse, l’identité des cellules peut également être déterminée d’après les propriétés fonctionnelles des cellules vivantes, notamment en ce qui concerne leurs potentiels de différenciation et de prolifération en culture ou leurs caractéristiques électrophysiologiques.

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Figure 11 : Méthodes in vivo d’analyse des lignages neuraux du SNC

Ces trois approches peuvent être employées pour étudier in vivo les lignages neuraux au cours du développement ou chez l’adulte. A. Les cellules en division incorporent la bromodésoxyuridine (BrdU) pendant la phase S du cycle cellulaire. Elles sont ensuite identifiées sur coupe par immunofluorescence contre la BrdU et des marqueurs des différents lignages neuraux, ici les marqueurs neuronaux NeuN et DCX. B. Un rétrovirus peut aussi servir à marquer une partie des cellules en division. Après injection stéréotaxique dans le SNC, le génome viral s’intègre dans l’ADN des cellules infectées au moment de la mitose. Ces cellules et leur descendance sont ensuite repérées grâce à un gène rapporteur (ici la GFP). C. Des souris transgéniques peuvent également être créées afin d’insérer un gène rapporteur sous le contrôle d’un promoteur d’un gène spécifique de certaines sous-populations cellulaires (par exemple les neurones immatures DCX+ de l’hippocampe). NeuN : Neuronal Nuclear marker; DCX : doublecortine; GFP : Green Fluorescent Protein; DAPI : 4',6-DiAmidino-2-PhénylIndole (marqueur nucléaire). Tiré de Ming & Song 2005

c. Quelques relations établies de lignages gliaux Quelles sont les relations de lignage entre les différentes cellules souches et progénitrices capables de générer des cellules gliales au cours du développement ? La seule 29

hypothèse difficilement contestable, c’est que les NEP sont à l’origine des autres types de précurseurs et, en bout de ligne, des cellules gliales différenciées mais la plupart des liens intermédiaires restent à vérifier. En effet, c’est un sujet encore jeune, sur lequel peu d’équipes de recherche se sont penchées. Qui plus est, les tests décrits plus haut sont rarement tous utilisés dans une seule étude, ce qui empêche d’obtenir une vision complète d’un lignage. Une première approche pour comprendre les lignages a consisté à observer l’ordre d’apparition des différents types de précurseurs. Ainsi, Liu et ses collaborateurs ont déterminé l’expression spatio-temporelle d’un grand nombre de marqueurs gliaux dans la moelle épinière de rat en développement (Liu et al. 2002). Voici un bref résumé de leurs résultats (Figure 12). Les NEP Sox2+ sont présents dès E10,5. Puis les GRP (A2B5+), premiers précurseurs gliaux, apparaissent vers E12,5. Vers E14, on peut détecter RC1, marqueur de glie radiaire. Le stade d’apparition des APC est moins bien connu : des cellules CD44+ sont décelées dès E11,5, mais il reste à déterminer leur identité exacte. Quoi qu’il en soit, des astrocytes GFAP+/CD44+ existent à E18,5. En ce qui concerne le lignage oligodendrocytaire, il y a clairement des OPC NG2+ à E14,5 et NG2+/Nkx2.2+ à E18, et des oligodendrocytes O4+/GalC+ vers E20-E21. Néanmoins, l’apparition successive des populations gliales suggère des relations de lignage mais ne les démontre pas. Des recherches récentes ont tenté de mettre certaines d’entre elles en évidence par d’autres techniques. Par exemple, des cultures clonales de NEP indiquent que les GRP seraient l’étape obligée du lignage allant des cellules souches aux cellules gliales différenciées (Rao & Mayer-Proschel 1997, Rao et al., 1998). En particulier, in vitro du moins, les GRP donnent naissance aux OPC, qui à leur tour produisent des oligodendrocytes (Gregori et al. 2002; Liu & Rao 2004; Noble et al. 2004). Quant au lignage astrocytaire, plusieurs voies de développement sont envisageables (Goldman 2004). D’une part, les astrocytes pourraient dériver de la glie radiaire dans tout le SNC, notamment dans la moelle épinière, tel que le suggère l’apparition successive de marqueurs gliaux (Hirano & Goldman 1988). D’autre part, du moins dans le prosencéphale et le cervelet, des expériences de traçage par rétrovirus montrent que les astrocytes pourraient aussi provenir de la différenciation de précurseurs migratoires en provenance de la ZSV, précurseurs peut-être apparentés aux GRP puisqu’ils génèrent également des oligodendrocytes (Levison & Goldman 1993, Levison 1993, Luskin & McDermott 1994). En plus de ces analyses d’expression de marqueurs, de cultures et d’infection par des rétrovirus, on dispose à présent d’outils génétiques très intéressants pour perturber les lignages gliaux et pour les suivre in vivo en marquant un type de précurseur et sa descendance. Ainsi, l’inactivation génétique d’un récepteur du FGF empêche le 30

développement des cellules souches sensibles à l’EGF, suggérant qu’elles dérivent des NEP dépendantes du FGF (Tropepe et al. 1999). Par ailleurs, la genèse d’oligodendrocytes et d’astrocytes à partir de cellules de la glie radiaire a été démontrée dans une zone restreinte de la moelle épinière grâce à des souris modifiées génétiquement Dbx1-Cre/Rosa26-GFP qui ont permis de marquer des cellules de glie radiaire et leur lignage (Fogarty et al. 2005). La figure 12 illustre sommairement ces hypothèses de lignages gliaux. De nombreuses études sont en cours pour les vérifier, les compléter et déterminer leurs variations régionales. Figure 12 : Relations de lignage possibles entre les différents précurseurs gliaux au cours du développement du SNC

Des cellules souches (les cellules neuroépithéliales et, plus tard, les cellules souches sensibles à l’EGF) génèreraient la glie radiaire, des précurseurs neuronaux et les GRP (ici simplement représentés comme un seul type cellulaire). A leur tour, les GRP donneraient naissance à des précurseurs d’astrocytes (APC), qui produiraient des astrocytes à partir de E16-18, et à des précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), qui génèreraient ensuite des oligodendrocytes vers E20. Certains travaux ont montré que la glie radiaire donnerait elle aussi naissance à des neurones, puis à des astrocytes et même à des oligodendrocytes. L’échelle de temps indique l’âge approximatif auquel les différents types cellulaires commencent à être détectés chez le rat. APC : Astrocyte Precursor Cell; E : jour embryonnaire; GRP : Glial Restricted Precursor; OPC : Oligodendrocyte Precursor Cell; P : jour postnatal. Tiré de Liu et al. 2002 31

III. Gliogenèse dans le SNC adulte Les manuels de neurosciences présentent souvent les cellules gliales comme des cellules du cerveau capables de se diviser, contrairement aux neurones2. Il est vrai que, lorsque le système nerveux adulte subit une lésion, par exemple lors d’un accident vasculaire cérébral, les neurones endommagés ne sont pas remplacés, alors que de la glie réactionnelle (proliférative) est retrouvée au site de la lésion. Cependant, cette façon de présenter la glie donne l’impression qu’elle est constamment en division, alors que, in vivo, les cellules macrogliales matures prolifèrent très peu (Horner et al. 2000; Levine et al. 2001). En revanche, il existe des cellules souches ou des progéniteurs qui permettent la genèse de nouvelles cellules neuronales ou gliales dans diverses régions du SNC mature et intact. Quelles sont alors les cellules responsables de la gliogenèse adulte ? On peut envisager que ce soient des précurseurs gliaux, mais également des cellules souches, ou encore des cellules gliales différenciées qui rentrent dans le cycle cellulaire. C’est Altman qui, dans les années 1960, a le premier utilisé une méthode suffisamment sensible pour déceler les cellules en mitose dans le cerveau de rongeur adulte, à savoir l’injection de thymidine tritiée, qui s’incorpore dans l’ADN pendant la division cellulaire (Altman & Das 1965a; Altman & Das 1965b; Altman 1969). Les cellules marquées ont pu être identifiées, d’abord par des analyses d’histologie et de microscopie électronique (Korr et al. 1973; Kaplan & Hinds 1980). A présent, la BrdU et des marqueurs du cycle cellulaire (PCNA, Ki67, phospho-histone H3) sont employés pour marquer les cellules qui prolifèrent, conjointement à des anticorps qui reconnaissent spécifiquement les neurones ou les cellules gliales. De plus, comme pour les études menées sur le système nerveux en développement, des cultures, notamment de neurosphères, ainsi que des greffes ont aussi servi à déterminer les potentiels de différenciation et d’auto-renouvellement des cellules souches ou progénitrices adultes (voir par exemple Reynolds & Weiss 1992; Richards et al. 1992; Lois & Alvarez-Buylla 1993; Morshead et al. 1994 ; Gage et al. 1995). On a ainsi identifié quelques types cellulaires générant de nouvelles cellules, notamment gliales, chez l’adulte.

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« Glial cells differ from neurons in that they possess no synaptic contacts and retain the ability to divide throughout life, particularly in response to injury. » (Raine 1999).

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1. Cellules souches adultes Comme pendant le développement, une cellule souche neurale adulte est définie par sa capacité à s’auto-renouveler et à générer neurones, astrocytes et oligodendrocytes. A ce jour, des cellules présentant ces propriétés, du moins in vitro, ont été identifiées dans des zones très variées du SNC chez les mammifères adultes : l’hippocampe et la zone sous-ventriculaire (ZSV) des ventricules latéraux (Reynolds & Weiss 1992; Richards et al. 1992; Palmer et al. 1995), mais aussi de nombreuses autres régions comme le striatum, le cortex, le septum, la moelle épinière et le complexe vagal dorsal (CVD) (Palmer et al. 1995; Weiss et al. 1996a; Shihabuddin et al. 1997; Palmer et al. 1999; Lie et al. 2002; Bauer et al. 2005). Toutefois, même si ces cellules présentent in vitro les propriétés des cellules souches neurales, elles ne donnent naissance à de nouveaux neurones in vivo que dans quelques zones du SNC adulte. En effet, une neurogenèse secondaire relativement importante a été détectée uniquement dans le gyrus dentelé de l’hippocampe et dans le système ZSV-bulbe olfactif (Cameron 1993; Lois & Alvarez-Buylla 1994). En dehors de ces deux régions, la formation de nouveaux neurones n’a pu être clairement démontrée ou ne concerne que très peu de cellules (Emsley et al. 2005). A côté de la neurogenèse secondaire, la gliogenèse à partir des cellules souches adultes n’a reçu qu’une attention bien limitée. Les cellules souches neurales contribuent-elles naturellement à la genèse de nouvelles cellules gliales chez l’adulte ? C’est du moins le cas dans le CVD, où une incorporation cumulative de BrdU pendant 10 jours permet de marquer une même proportion de neurones NeuN+ et de cellules gliales S100B+ (Bauer et al. 2005). Par contre, il semblerait que les cellules souches de la ZSV antérieure et du gyrus dentelé produisent très majoritairement des neurones dans des conditions normales (Cameron et al. 1993; Corotto et al. 1993; Lois & Alvarez-Buylla 1994). Lorsque les cellules de la ZSV sont suivies grâce à l’injection de rétrovirus, seulement 1% des cellules ainsi marquées se retrouvent dans le corps calleux une semaine plus tard et expriment des marqueurs du lignage oligodendrocytaire (Hack et al. 2005). Cette proportion peut toutefois être augmentée dans des conditions pathologiques. Par exemple, lors d’une atteinte de la myéline, des cellules dérivées de la ZSV peuvent être recrutées à la lésion, en dehors de leur trajet migratoire habituel vers le bulbe olfactif, et se différencier en oligodendrocytes et en astrocytes (NaitOumesmar et al. 1999; Picard-Riera et al. 2002). Notons cependant que, dans tous ces cas, l’identité exacte des cellules donnant naissance à des cellules gliales n’a pas été déterminée : il peut s’agir de cellules souches comme de progéniteurs plus restreints dans leur potentiel de différenciation ou leur capacité à proliférer. D’un point de vue développemental, l’origine des cellules souches adultes n’est pas complètement élucidée. Des travaux récents utilisant le traçage génétique indiquent que les 33

cellules souches de la ZSV dérivent de la glie radiaire embryonnaire (Figure 13) (AlvarezBuylla et al. 2001; Merkle et al. 2004). Figure 13 : Origine développementale des cellules souches de la ZSV adulte

A,B. Les cellules souches du neuroépithélium génèrent des neurones (A), ainsi que la glie radiaire (B). Celle-ci donne à son tour naissance à des neurones qui migrent ensuite dans le cortex le long des prolongements gliaux. Cette neurogenèse passe peut-être par un stade de progéniteur d’amplification transitoire (en vert). C. La glie radiaire génère également les cellules souches maintenues dans la zone sousventriculaire (ZSV) adulte, qui produisent de nouveaux neurones du bulbe olfactif. NEP : NeuroEpithelial Precursor. Tiré de Alvarez-Buylla et al. 2001

2. Cellules NG2+ (« OPC adultes ») Parmi les précurseurs susceptibles de générer des cellules gliales chez l’adulte, les plus étudiés sont les cellules exprimant à leur surface le protéoglycane NG2. En effet, deux heures après une injection unique de BrdU, la principale population cellulaire en division dans le cerveau adulte (hors ZSV) est constituée de cellules NG2+. Elles représentent de 70 à 75% des cellules en prolifération, les autres cellules BrdU+ étant majoritairement des cellules endothéliales (Dawson et al. 2003). Des résultats semblables sont obtenus dans la moelle épinière après une injection quotidienne de BrdU pendant 12 jours (Horner et al. 2000). Ces cellules gliales sont souvent appelées précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) ou O-2A adultes à cause de leur profil antigénique (voir ci-dessous) et de leur capacité à générer des oligodendrocytes et des astrocytes de type 2 en culture. Néanmoins, il faut souligner qu’il existe un débat encore non résolu concernant l’hétérogénéité de la population de cellules gliales NG2+ : ont-elles toutes la capacité de se diviser et de générer des oligodendrocytes in 34

vivo ? Nous verrons que certains auteurs mettent cette affirmation en doute et préfèrent par conséquent éviter le terme d’OPC. Dans la présente introduction, « OPC adultes » et « glie NG2+ » seront cependant considérés comme synonymes. D’abord isolés dans le nerf optique (ffrench-Constant & Raff 1986; Wolswijk & Noble 1989), les OPC adultes sont en fait retrouvés dans tout le SNC, dispersés à la fois dans les substances blanche et grise, et représentent entre 5 et 8% de la population gliale du SNC (Dawson et al. 2000). In vitro, les OPC adultes sont de petites cellules unipolaires ou bipolaires reconnues par les anticorps A2B5, O4 et NG2 (Levine et al. 2001). Par contre, in vivo, les cellules NG2+ sont parfois bipolaires mais ont souvent une morphologie très ramifiée de cellules plus différenciées (Levine & Card 1987; Butt et al. 1999; Berry et al. 2002; Butt et al. 2005). Fait à souligner, les cellules NG2+ qui incorporent la BrdU+ seraient bipolaires (Horner et al. 2000). Comme les OPC périnataux, les OPC adultes expriment NG2, PDGFRα, O4, Olig1, Olig2, les récepteurs du FGF2 et peut-être Nkx2.2 mais, hormis Olig1 et Olig2, aucun marqueur d’oligodendrocytes matures (MOG, MBP) n’est retrouvé in vivo chez les OPC adultes (Levine et al. 1993; Nishiyama et al. 1996a; Redwine et al. 1997; Reynolds & Hardy 1997; Butt et al. 1999; Watanabe et al. 2004; Kitada & Rowitch 2006). Ils sont également distincts des cellules exprimant des marqueurs d’astrocytes (GFAP, S100, vimentine), de neurones (NeuN) et de microglie (OX42, ILB4) (Levine & Card 1987; Levine et al. 1993; Nishiyama et al. 1997; Reynolds & Hardy 1997; Butt et al. 1999; Ong & Levine 1999; Nishiyama et al. 2002). Par contre, tel que mentionné précédemment, des cellules échappent à cette classification simple, notamment dans l’hippocampe, où le marqueur neuronal TOAD-64 est retrouvé dans des cellules NG2+ (Belachew et al. 2003). Par

ailleurs,

certaines

cellules

NG2+

adultes

possèdent

des

propriétés

électrophysiologiques uniques. Contrairement aux astrocytes, elles ne sont pas couplées par des jonctions communicantes (Lin & Bergles 2002). De plus, même si elles ne peuvent générer de potentiels d’actions à la manière des neurones, elles expriment des conductances aux ions Na+, K+ et Ca2+ dépendantes du voltage et des récepteurs de divers neurotransmetteurs (voir Lin & Bergles 2002 et Belachew & Gallo 2004 pour des revues sur le sujet). Plus surprenant encore, le laboratoire du Dr Bergles a montré que des cellules NG2+ de l’hippocampe et du cervelet reçoivent des contacts synaptiques fonctionnels en provenance de neurones GABAergiques et glutamatergiques (Bergles et al. 2000; Lin & Bergles 2002; Lin & Bergles 2004; Lin et al. 2005). Le rôle exact de ces synapses reste à élucider ; il pourrait s’agir d’influencer la prolifération et la différenciation de ces OPC présumés (Lin & Bergles 2004).

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Les cellules NG2+ adultes réagissent fortement à une grande variété d’atteintes du SNC (Chen et al. 2002) et l’on considère généralement que ce sont elles qui repeuplent les lésions démyélinisantes et s’y différencient en nouveaux oligodendrocytes pour assurer la remyélinisation (Levine 1994; Keirstead et al. 1998; Redwine & Armstrong 1998; Di Bello et al. 1999; Levine & Reynolds 1999; Levison et al. 1999; Reynolds et al. 2002; Watanabe et al. 2002; Polito & Reynolds 2005). Des travaux récents indiquent aussi qu’elles pourraient être à l’origine de la cicatrice gliale qui se forme après une lésion traumatique faite au moyen d’un instrument tranchant (Alonso 2005), et même générer des neurones dans l’hippocampe (Belachew et al. 2003). Cependant, une fraction notable des cellules NG2+ marquées à la BrdU maintiennent l’expression de NG2 après 10 jours (Dawson et al. 2003) et même quatre semaines (Horner et al. 2000), ce qui suggère qu’elles ne se différencient pas davantage. Plusieurs autres indications laissent entendre que les cellules NG2+ du SNC adulte pourraient avoir une autre fonction que celle de précurseurs. Par exemple, leur morphologie complexe rappelle plutôt la forme de cellules différenciées (Berry et al. 2002; Butt et al. 2005). De plus, les cellules NG2+ établissent des contacts privilégiés avec les nœuds de Ranvier dans la substance blanche et les synapses neuro-neuronales au sein de la substance grise (Butt et al. 1999; Bergles et al. 2000; Butt et al. 2002). C’est pourquoi certains auteurs proposent de les considérer comme une classe de macroglie à part entière, qui porterait des noms tels synantocytes (Butt et al. 2002), polydendroglie (Nishiyama et al. 2002) ou cellules neurogliales ß (Peters 2004). En plus de participer à la formation de la cicatrice gliale, la glie NG2+ pourrait avoir comme fonction de mettre en place et stabiliser les synapses et les nœuds de Ranvier (Butt et al. 2002). Bien entendu, rien ne permet d’exclure la possibilité que les cellules NG2+ soient en fait une population hétérogène, dont seulement une partie serait des précurseurs d’oligodendrocytes (Polito & Reynolds 2005) ou de neurones (Belachew et al. 2003). Enfin, en ce qui concerne l’origine développementale des cellules NG2+ adultes, le consensus général veut qu’elles descendent des OPC périnataux (Wren et al. 1992). C’est du moins ce que suggère une étude récente, qui montre que les cellules NG2+ ne se développent pas chez des souris déficientes pour Olig2 (Ligon et al. 2006), gène également indispensable au développement des oligodendrocytes (Lu et al. 2002; Zhou & Anderson 2002). Toutefois, comme il existe peut-être plusieurs sous-populations d’OPC périnataux (Spassky et al. 2000; Mallon et al. 2002), l’une pourrait donner naissance aux oligodendrocytes, l’autre aux OPC adultes (Butt et al. 2002; Nishiyama et al. 2002).

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3. Autres sources de gliogenèse adulte Des cellules gliales nouvellement formées ont souvent été observées dans le SNC adulte intact ou lésionnel (par exemple, voir Hommes & Leblond 1967; Korr et al. 1973; Kaplan & Hinds 1980; Gensert & Goldman 1996; Mao & Wang 2001; Rietze et al. 2000; Gotts & Chesselet 2005). Cependant, dans ces études, les approches techniques utilisées permettent rarement de déterminer si ces nouvelles cellules gliales proviennent de précurseurs distincts des cellules souches ou des cellules NG2+. En particulier, le renouvellement des astrocytes s’explique-t-il en partie par la prolifération de cellules déjà engagées dans le lignage astrocytaire ? Une étude le suggère : dans le cortex de rat, les cellules S100B+ (considérées comme des astrocytes) y représenteraient une forte proportion des cellules BrdU+ un jour ou quatre semaines après une injection de BrdU (Ehninger & Kempermann 2003). Cependant, des résultats potentiellement contradictoires ont aussi été obtenus : juste après injection de BrdU, seuls de rares astrocytes GFAP+ sont également BrdU+ dans la moelle épinière et le cerveau (Horner et al. 2000; Dawson et al. 2003). Ces conclusions méritent donc d’être confirmées, d’autant plus que S100B a été retrouvé dans certaines cellules du lignage oligodendrocytaire, ce qui remet en question son utilisation comme marqueur d’astrocytes (Deloulme et al. 2004; Hachem et al. 2005). En fait, il apparaît clairement qu’une combinaison de marqueurs doit être utilisée pour identifier chaque type cellulaire, ce qui est d’autant plus valable pour les astrocytes que certaines cellules GFAP+ seraient en fait des cellules souches ou des progéniteurs multipotents, pas de simples astrocytes (Doetsch et al. 1999; Steiner et al. 2004). Par ailleurs, il est important d’étudier le phénotype des cellules BrdU+ à au moins deux moments, par exemple juste après l’injection de BrdU et quelques jours ou semaines plus tard, ce qui permet de savoir d’abord quelles cellules incorporent la molécule et ensuite quel est leur devenir.

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B. LA NEUROHYPOPHYSE DE RONGEUR COMME MODELE D’ETUDE DU LIGNAGE GLIAL Il ressort de cette revue bibliographique que les cellules susceptibles de générer de nouvelles cellules gliales sont encore méconnues, tant au cours du développement que chez l’adulte. Afin d’approfondir les connaissances sur le sujet, la neurohypophyse (NH) de rongeur apparaît comme un modèle intéressant de par sa composition cellulaire simple et la persistance chez l’adulte d’une gliogenèse modulable selon les conditions physiologiques. De plus, sa localisation anatomique fait qu’elle a souvent été écartée des préparations de SNC. Par conséquent, au moment où cette thèse a débuté, les techniques récentes d’étude des lignages gliaux n’avaient pas encore été appliquées à la NH. Pour ces raisons, j’ai entrepris de réexaminer la gliogenèse dans la NH, au cours du développement ainsi que chez l’adulte.

I. Brève anatomie de l’hypophyse L’hypophyse est une glande endocrine logée dans la selle turcique de l’os sphénoïde, à la base de l’hypothalamus, auquel elle est reliée par la tige pituitaire. Complètement entourée par la dure-mère, qui la sépare du cerveau, elle est donc située en dehors de la barrière hématoméningée (Hanoune 1996). Elle est subdivisée en trois lobes, tel qu’illustré sur la figure 14.

1.Neurohypophyse Le lobe postérieur de l’hypophyse, ou neurohypophyse (NH), ou encore pars nervosa, fait partie du SNC. Il contient les terminaisons nerveuses de neurones hypothalamiques, dont la fonction est de libérer directement dans la circulation générale des neurohormones, la vasopressine et l’ocytocine. Ses composantes cellulaires et sa physiologie sont détaillées plus bas.

2. Adénohypophyse L’autre lobe principal de l’hypophyse se nomme l’adénohypophyse (AH), ou pars anterior, et comporte divers types de cellules endocrines. Dans l’hypothalamus, des neurones neurosécréteurs déversent dans le système porte hypophysaire différentes hormones qui, une fois dans l’AH, ont une action essentiellement stimulante sur les cellules endocrines. A leur 38

tour, celles-ci sécrètent alors dans la circulation générale d’autres hormones régulant l’ensemble des glandes de l’organisme (Silbernagl & Despopoulos 1997).

3. Lobe intermédiaire Enfin, il existe chez les vertébrés dits inférieurs, mais sous forme extrêmement réduite chez l’humain adulte (Bucy 1932), un petit lobe intermédiaire (LI) entre la NH et l’AH. Ses cellules principales sécrètent la mélanostimuline (MSH), qui contrôle notamment la pigmentation de la peau (Nussey & Whitehead 2001).

Figure 14 : Anatomie de l’hypophyse

A. Schéma d’une coupe sagittale de cerveau de rongeur adulte. L’hypophyse est située sous le cerveau, reliée à l’hypothalamus par la tige pituitaire. Elle est composée de trois lobes: la neurohypophyse (NH), le lobe intermédiaire (LI) et l’adénohypophyse (AH). B. Les neurones magnocellulaires de l’hypothalamus projettent leurs axones dans la neurohypophyse et libèrent les neurohormones ocytocine et vasopressine dans la circulation générale.

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II. Composition cellulaire de la neurohypophyse La NH est composée d’un nombre restreint de types cellulaires (récapitulés dans le tableau 4). En effet, elle contient les axones de neurones hypothalamiques mais ne comporte aucun corps cellulaire neuronal. Outre les cellules des vaisseaux sanguins sur lesquels se terminent ces axones, l’élément cellulaire majeur est le pituicyte, une cellule gliale souvent apparentée à l’astrocyte.

1. Axones Les axones présents dans la NH proviennent essentiellement des neurones magnocellulaires des noyaux supraoptiques et paraventriculaires de l’hypothalamus (Silverman & Zimmerman 1983) et sont principalement non myélinisés (Bucy 1932; Schober & Hoheisel 1977). Ils sont le lieu de stockage et de relargage de deux hormones : la vasopressine et l’ocytocine. Les vésicules hormonales renferment également une protéine distincte pour chaque hormone et servant au transport le long de l’axone, les neurophysines (Hanoune 1996). Des études par microscopie électronique ont identifié plusieurs types de vésicules dans les axones de la NH : des granules de sécrétion denses aux électrons, où sont stockées vasopressine et ocytocine, ainsi que de nombreuses petites vésicules claires ressemblant à des vésicules synaptiques (Navone et al. 1989). En fait, la NH comporte non seulement les terminaisons sécrétrices d’ocytocine et de vasopressine, mais aussi des axones qui contiennent de l’enképhaline, du GABA, de la noradrénaline, de la sérotonine et de le monoxyde d’azote (NO) (van Leeuwen et al. 1998). La fonction de ces neurotransmetteurs pourrait être de moduler la sécrétion hormonale. Ces différents types de fibres forment des contacts synaptiques entre eux ainsi que des jonctions synaptoïdes avec des pituicytes (Monroe & Scott 1966; Tweedle & Hatton 1980). Par contacts synaptoïdes, on entend des jonctions neurono-gliales qui, en microscopie électronique, possèdent des microvésicules claires et du matériel dense aux électrons du côté présynaptique mais souvent pas de caractéristiques postsynaptiques dans le pituicyte (Baumgarten et al. 1972). Afin de visualiser ces fibres nerveuses, on peut utiliser des anticorps dirigés contre différentes protéines, par exemple les neurofilaments, la vasopressine ou l’ocytocine, ou encore la synthase neuronale de monoxyde d’azote (nNOS).

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2. Vaisseaux sanguins La NH est une structure richement vascularisée. Un réseau de capillaires fenestrés assure son irrigation à partir des artères hypophysaires inférieures, branches de la carotide interne. La NH contient donc de nombreuses cellules endothéliales et périvasculaires (fibroblastes, péricytes, microglie, mastocytes) (Nordmann 1977; Paterson & Leblond 1977; Seyama et al. 1980). Le rôle de ces vaisseaux sanguins est non seulement de permettre les échanges gazeux entre le sang et les cellules de la NH, mais aussi de recevoir les hormones neurohypophysaires et de les transporter vers la circulation générale. Dans la NH, les axones neurosécréteurs ont en effet des contacts privilégiés avec les capillaires sanguins : les terminaisons axoniques se prolongent souvent dans la lame basale des cellules endothéliales (Tweedle et al. 1989). Sur des coupes de NH, ces dernières peuvent être reconnues grâce à la forme allongée de leur noyau et au marquage à l’isolectine B4 (ILB4) (Laitinen 1987). De plus, parmi les cellules périvasculaires, il existe des cellules microgliales un peu particulières qui constituent environ 20% des cellules non endothéliales de la NH adulte (Mander & Morris 1996). Leur fonction serait de phagocyter les terminaisons des axones neurosécréteurs qui obstruent l’espace périvasculaire (Pow et al. 1989). On peut les distinguer des pituicytes au moyen de nombreux marqueurs (Guillemin & Brew 2004), notamment ILB4 (Streit & Kreutzberg 1987) et l’anticorps anti-CD11b, clone OX42 (Robinson et al. 1986; Ling et al. 1990).

3. Pituicytes Enfin, les cellules les plus nombreuses dans la NH sont les pituicytes. A l’origine, leur morphologie les a distingués des astrocytes (Bucy 1932), mais peu à peu, d’autres propriétés les en ont rapprochés (Livingston 1976). Par exemple, leur fonction serait de réguler l’environnement ionique immédiat des axones neurosécréteurs (Dellmann et al. 1974, cité dans Tweedle & Hatton 1980) et de contrôler la sécrétion des neurohormones, comme nous le verrons plus bas. De plus, leurs multiples prolongements cellulaires sont fortement interconnectés par différents types de jonctions, dont des jonctions communicantes (OlivieriSangiacomo 1973; Dreifuss et al. 1975; Stoeckel et al. 1975). Surtout, les pituicytes sont souvent considérés comme des cellules astrogliales parce que, chez le rat, ils expriment la vimentine (Marin et al. 1989) et S100B (Cocchia & Miani 1980), deux marqueurs du lignage astrocytaire. La protéine GFAP, un marqueur classique d’astrocytes, est aussi décelée dans les pituicytes chez le rat et l’humain (Salm et al. 1982; Velasco et al. 1982) mais pas chez la souris (d’après nos propres observations). Par contre, les pituicytes expriment certains 41

marqueurs de cellules neurales immatures qu’on ne trouve habituellement pas dans les astrocytes, comme PSA-NCAM (Theodosis et al. 1991) et la protéine Low Molecular Weight Microtubule-Associated Protein-2 (LMW MAP-2) (Matsunaga et al. 1999), ainsi que la vimentine, qui disparaît au cours de la maturation des astrocytes dans le reste du SNC (Dahl et al. 1981; Bignami et al. 1982). Les pituicytes seraient donc des cellules gliales spécialisées distinctes des astrocytes.

Tableau 4 : Les types cellulaires de la NH de rat adulte Nom

Fonction

Axones (dont les axones neurosécréteurs)

Neurosécrétion de vasopressine et d’ocytocine, modulation de cette sécrétion par d’autres transmetteurs

Vaisseaux sanguins

Paroi des vaisseaux sanguins

Cellules endothéliales Péricytes Microglie Fibroblastes Mastocytes

Pituicytes

Contraction des capillaires Phagocytose, création de l’espace périvasculaire Synthèse de composants extracellulaires Réponse inflammatoire et allergique, régulation de la perméabilité vasculaire… Modulation de la neurosécrétion ?

Exemples de marqueurs Neurofilaments, ocytocine, vasopressine, nNOS, PSA-NCAM ILB4, PECAM/CD31 NG2, nestine, PECAM/CD31, αSMA, PDGFRβ ILB4, OX42, CD45 Fibronectine CD34, CD45, histamine GFAP, S100B, vimentine, PSANCAM, MAP2

Références : Olivieri-Sangiacomo 1972; Paterson & Leblond 1977; Cocchia & Miani 1980; Laitinen 1987; Streit & Kreutzberg 1987; Marin et al. 1989; Pow et al. 1989; Theodosis et al. 1991; Mander & Morris 1996; Silver et al. 1996; Matsunaga et al. 1999; Guillemin & Brew 2004; Dore-Duffy et al. 2006.

III. Formation ontogénique

1. Développement des lobes L’origine embryonnaire de l’hypophyse est double : d’une part, une invagination du plancher du troisième ventricule cérébral forme la NH au niveau du prosomère p5 et, d’autre part, l’AH et le LI proviennent d’un diverticule ectodermique du stomodeum, c’est-à-dire la future bouche (Figure 15 A). Un échange de signaux inducteurs entre ces deux régions permet leur développement parallèle (Treier & Rosenfeld 1996; Dasen & Rosenfeld 1999). 42

Au commencement, l’ectoderme oral contacte l’épithélium neural sus-jacent et devient peu à peu une structure appelée la poche de Rathke, formée vers E11 chez le rat. Puis vers E11,5 apparaît au niveau du diencéphale la cavité infundibulaire (Figure 15 B), qui s’élargit ensuite. La poche de Rathke se détache de la cavité orale vers E14 (Figure 15 C). Ses cellules présentent alors une activité proliférative intense, qui remplit petit à petit la lumière de la poche de Rathke. En revanche, le diverticule diencéphalique présente toujours une lumière assez large à ce stade et celle-ci ne diminue grâce à de la prolifération cellulaire que vers E17E18. A la fin de la vie embryonnaire, l’hypophyse présente la même organisation que chez l’adulte (Figure 15 D). Quant à la tige pituitaire, elle a la même origine que la NH et est entourée en grande partie par une extension de la poche de Rathke appelée lobe tubéral ou pars tuberalis (Dubois et al. 1997; Sheng & Westphal 1999; Kaufman 2001). Figure 15 : Développement embryonnaire de l’hypophyse de rongeur

Schémas représentant la formation de l’hypophyse d’après des sections sagittales d’embryons de rat à quatre stades de développement. Les âges correspondant aux mêmes stades chez la souris sont indiqués en italique. A. Vers E8,5 apparaît un épaississement de l’ectoderme oral préfigurant la future poche de Rathke. B. La formation d’une poche de Rathke (PR) rudimentaire commence vers E11: on observe un bourgeonnement épithélial pointant vers le tissu neural sus-jacent. C. La poche de Rathke continue ensuite à s’étendre vers le haut et se détache de la cavité orale vers E14. Entre-temps, le plancher du diencéphale (Di) forme un diverticule dirigé vers la poche: ce sera la neurohypophyse (NH). Des fibres nerveuses y entrent et viennent contacter des vaisseaux sanguins en formation. D. La poche de Rathke se remplit ensuite de cellules par prolifération et devient l’adénohypophyse (AH). Sa paroi dorsale constitue quant à elle le lobe intermédiaire (LI). La lumière de la NH se referme aussi peu à peu et, à la fin de la gestation, l’anatomie de l’hypophyse ressemble déjà à celle retrouvée chez l’adulte. CO : chiasma optique; I : infundibulum; Més : mésencéphale; MO : membrane orale; O : cavité orale; PN : plaque neurale; PP : préplaque; Pro : prosencéphale; Rh : rhombencéphale; V : ventricule. Tiré de Sheng & Westphal 1999 43

2. Différenciation des constituants cellulaires de la neurohypophyse Au niveau cellulaire, les différentes composantes de la NH se développent en parallèle, en s’influençant les unes les autres. Par exemple, les pituicytes qui se différencient les premiers sont ceux en contact avec des axones (Galabov & Schiebler 1978) et, dans une souris mutante dépourvue de projections axoniques dans la NH, les pituicytes ne survivent pas (Schonemann et al. 1995). D’après des études d’histologie, on peut distinguer trois périodes de maturation de la NH (Galabov & Schiebler 1978). La première s’étend jusqu’à E17 chez le rat. Pendant cette période, l’ébauche de la NH ressemble d’abord à une masse de cellules identiques, puis leur différenciation débute : elles présentent de nouveaux organites et des granules de lipoprotéines et leur ultrastructure générale rappelle celle des cellules gliales immatures. C’est aussi à ce moment que les premières fibres nerveuses pénètrent dans la structure et qu’apparaissent des cellules endothéliales et périvasculaires (vers E14). Puis, entre E18 et la fin du premier mois postnatal, les fibres nerveuses sont plus nombreuses et forment des contacts neurovasculaires et neuro-gliaux et l’on distingue les premiers signes de neurosécrétion (Galabov & Schiebler 1978). La fenestration des capillaires apparaît vers la naissance (Dellmann et al. 1978), puis les cellules endothéliales deviennent plus fines, il se forme un espace périvasculaire et une lame basale. On commence aussi à observer des cellules microgliales phagocytant des axones dans la NH, ce qui suggère que ce sont elles qui créent ainsi l’espace périvasculaire (Olivieri-Sangiacomo 1972; Pow et al. 1989). De plus, les pituicytes ont une apparence de cellules actives, c’est-à-dire notamment que leur cytoplasme est dense et compte de nombreux organites (Galabov & Schiebler 1978). Enfin, jusqu’à l’âge de trois mois, les pituicytes perdent peu à peu ces signes d’activité, qu’ils ne retrouvent en grand nombre que lors d’une stimulation physiologique de la NH (Galabov & Schiebler 1978). Ces travaux mériteraient d’être complétés par des analyses d’expression de marqueurs de pituicytes au cours du développement de la NH. De plus, le lignage des pituicytes n’est pas élucidé. L’idée la plus généralement acceptée veut que les pituicytes dérivent des cellules épendymaires du plancher du troisième ventricule puisqu’on observe une continuité morphologique entre ces dernières et les cellules de l’ébauche de la NH (Livingston 1976; Galabov & Schiebler 1978).

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IV. Physiologie de la neurohypophyse

1. Hormones neurohypophysaires Dans la NH, les axones des neurones magnocellulaires sécrètent deux hormones dans les capillaires sanguins : l’ocytocine et la vasopressine (aussi appelée ADH, pour antidiuretic hormone, l’hormone anti-diurétique). La figure 16 résume les différentes situations physiologiques qui peuvent entraîner la sécrétion de ces deux neuropeptides ainsi que les effets sur leurs organes cibles. Figure 16 : Stimulation et effets de la sécrétion d’hormones neurohypophysaires

Stimulée par la tétée ou la distension vaginale, l’ocytocine induit l’éjection du lait ou la contraction de l’utérus. Chez les mâles, elle est plus fortement sécrétée au moment de l’éjaculation. L’ocytocine stimule aussi la sécrétion d’insuline et de glucagon et agit sur les adipocytes, ce qui indique son implication dans la régulation métabolique de l’alimentation. Avec l’ocytocine, la vasopressine est sécrétée suite à divers stimuli dénotant une perte hydrique (hyperosmolarité plasmatique, hypotension, hypovolémie due à une hémorragie…). En retour, les deux hormones interviennent dans la réaction à la déshydratation en stimulant notamment la vasoconstriction, la rétention d’eau, l’excrétion rénale de sodium et la coagulation.

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La vasopressine est libérée dans la circulation générale en réponse à des variations de la pression osmotique du sang ou de l’espace extracellulaire. Sa fonction est de contrôler l’équilibre hydrique. Lors d’une déshydratation par exemple, l’osmolarité plasmatique augmente, ce qui provoque, via les neurones osmorécepteurs de l’hypothalamus, une sécrétion accrue de vasopressine. Celle-ci stimule alors les tubules distaux des reins afin d’accroître la rétention d’eau et peut agir sur les artérioles et leurs afférences nerveuses pour entraîner une vasoconstriction (Hanoune 1996; Silbernagl & Despopoulos 1997). L’ocytocine est mieux connue pour son rôle dans la reproduction, puisque, chez les mammifères femelles, elle est impliquée dans la parturition et la lactation. En effet, elle peut induire la contraction de l’utérus et contrôle l’éjection du lait au niveau des cellules myoépithéliales des glandes mammaires lors de la tétée. L’ocytocine intervient aussi dans la régulation de l’équilibre hydrominéral puisque, après administration de sodium, elle stimule l’excrétion rénale de sodium en conjonction avec le facteur natriurétique auriculaire et inhibe le besoin de sel (Silbernagl & Despopoulos 1997).

2. Stimulation et plasticité morpho-fonctionnelle dans la neurohypophyse Nous avons vu que des stimulations physiologiques diverses peuvent provoquer la sécrétion des hormones neurohypophysaires, en particulier la déshydratation, la lactation et la parturition. Déshydratation et lactation sont fréquemment utilisées expérimentalement dans les études sur le fonctionnement de la NH. Dans notre laboratoire, le modèle que nous avons choisi est la stimulation par déshydratation car elle est facile à mettre en œuvre sans délai et une littérature abondante est disponible sur le sujet. Pour stimuler la NH par déshydratation, on peut soit priver l’animal d’eau, soit remplacer son eau de boisson par une solution saline. Dans les deux cas, il en découle une hyperosmolarité plasmatique, qui déclenche la sécrétion de vasopressine et d’ocytocine dans la NH. La figure 17 montre spécifiquement les actions des hormones mises en cause lors d’une déshydratation (Silbernagl & Despopoulos 1997).

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Figure 17 : Action des hormones impliquées lors d’une déshydratation ou d’un excès de sel

La déshydratation per se (A) et l’excès de sel dans l’organisme (B) provoquent tous deux une stimulation de la NH. A. Lors d’une déshydratation, le compartiment extracellulaire devient hypertonique. Cela stimule les neurones hypothalamiques, créant une sensation de soif et entraînant une sécrétion de vasopressine et d’ocytocine dans la NH. Transportée jusqu’aux reins par la circulation sanguine, la vasopressine y réduit l’excrétion d’eau. B. Un excès de sel dans l’organisme résulte aussi en une hausse de l’osmolarité plasmatique. Cela entraîne une libération d’hormones dans la NH et un freinage du système rénineangiotensine II-aldostérone, et donc une augmentation de la natriurèse. De plus, le volume du compartiment extracellulaire et du plasma augmente, ce qui se traduit par une libération de facteur natriurétique auriculaire, qui stimule l’excrétion de sodium. L’ocytocine inhibe également le besoin de sel ressenti par l’hypothalamus. De nombreuses études ont examiné les effets sur la NH d’une déshydratation prolongée, parfois suivie d’une période de réhydratation. Une telle stimulation entraîne non seulement la sécrétion des hormones vasopressine et ocytocine, mais aussi une hypertrophie de la NH, une prolifération accrue dans la NH, qui concerne notamment les pituicytes et les 47

cellules endothéliales, ainsi qu’une augmentation de l’activité phagocytaire de la microglie (Paterson & Leblond 1977; Tweedle & Hatton 1980; Kawamoto & Kawashima 1984; Mander & Morris 1994). De plus, la sécrétion des hormones neurohypophysaires s’accompagne de changements morphologiques importants remarqués dans la NH par microscopie électronique. En effet, on observe une multiplication et un élargissement des terminaisons neuronales (Tweedle & Hatton 1980; Theodosis et al. 1998). Qui plus est, en temps normal, les pituicytes entourent les axones neurosécréteurs, tandis que, lors d’une stimulation, les pituicytes ne sont plus retrouvés autour des axones (Figure 18). Les prolongements des pituicytes normalement positionnés entre les axones et les vaisseaux sanguins se rétractent en cas de stimulation (Matsunaga et al. 1999), ce qui accroît les contacts neurovasculaires (Wittkowski & Brinkmann 1974; Tweedle & Hatton 1980). La sécrétion de neurohormones serait ainsi favorisée (Theodosis 2002). Par ailleurs, la rétraction des pituicytes résulte en une hausse de la concentration extracellulaire de K+ (Leng & Shibuki 1987), ce qui dépolariserait les terminaisons axoniques et stimulerait davantage la sécrétion hormonale (Theodosis 2002). De plus, les contacts synaptoïdes entre les terminaisons axoniques et les pituicytes sont aussi plus nombreux dans la NH après trois jours de privation d’eau (Wittkowski & Brinkmann 1974). Ces changements morphologiques pourraient découler de l’action des neurohormones ou de neurotransmetteurs sur les pituicytes au niveau de ces contacts synaptoïdes (Boersma & Van Leeuwen 1994). Des études sur des cultures de pituicytes ont en particulier démontré l’action de l’adénosine et des neurohormones vasopressine et ocytocine sur la morphologie des pituicytes (Rosso et al. 2002a,b). Figure 18 : Changements morphologiques au cours d’une stimulation de la NH

Au cours d’une stimulation, la couverture gliale (en bleu) des terminaisons des neurones magnocellulaires est réduite, permettant l’augmentation de la zone de contact neurovasculaire. Ces mouvements faciliteraient la sécrétion des neurohormones dans la circulation générale. PSA-NCAM, représenté en jaune, constituerait un facteur permissif dans ces mouvements cellulaires.

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Des modifications similaires sont observées dans les noyaux hypothalamiques qui projettent dans la NH (voir Tweedle & Hatton 1980 pour une revue). Ces changements étant réversibles par une réhydratation (Tweedle & Hatton 1980; Kawamoto & Kawashima 1984), on parle donc de plasticité morpho-fonctionnelle. Différents facteurs permissifs semblent favoriser cette plasticité (Theodosis et al. 1998), notamment la forme polysialylée de la molécule neurale d’adhésion cellulaire (PSA-NCAM). Par exemple, retirer spécifiquement PSA sur NCAM par micro-injection de l’enzyme endoneuraminidase (endoN) dans le noyau supraoptique empêche les modifications normalement observées dans les contacts neuroneuronaux et neurono-gliaux après déshydratation ou pendant la lactation (Theodosis et al. 1999).

C. HYPOTHÈSES DE TRAVAIL Dépourvue de neurones et d’oligodendrocytes, la NH m’est apparue comme un modèle d’étude simple et encore inexploré pour analyser le développement des cellules gliales. D’après une étude de Wang et ses collaborateurs (Wang et al. 1994), des cellules rappelant les précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) sont présentes dans la NH de rats nouveau-nés. De plus, des travaux préliminaires de mon laboratoire avaient montré que, chez la souris, des morceaux de NH greffés dans une zone neurogénique (la ZSV) génèrent différents types de cellules, certaines exprimant des marqueurs d’astrocytes et d’oligodendrocytes. J’ai donc voulu tester l’hypothèse que la NH néonatale pourrait contenir soit des cellules souches, soit des précurseurs multipotents. Ces cellules souches ou précurseurs pourraient donner naissance aux pituicytes au cours du développement de la NH. Par ailleurs, la NH adulte est le siège d’une gliogenèse de base assez faible, fortement accentuée lors de stimulations physiologiques comme la déshydratation (Paterson & Leblond 1977; Murugaiyan & Salm 1995). De plus, des explants de NH adulte sont capables de générer des oligodendrocytes en culture (Coquillat 2001). Même chez l’adulte, la NH pourrait ainsi contenir des cellules souches ou progénitrices. In vivo, ces cellules pourraient servir à donner naissance à de nouveaux pituicytes. C’est la seconde hypothèse que j’ai souhaité vérifier.

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RESULTATS A. Article 1 : Des précurseurs d’oligodendrocytes génèrent des pituicytes

in

vivo

au

cours

du

développement

de

la

neurohypophyse (Virard et al. 2006)

I. Approche expérimentale Dans un premier temps, je voulais tester l’hypothèse que la NH de rat nouveau-né contient des précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) et que ces OPC sont à l’origine des pituicytes. Mon premier objectif a donc consisté à caractériser les cellules de la NH néonatale. J’ai utilisé des marqueurs variés pour identifier les précurseurs présents dans la NH et définir les étapes de différenciation des pituicytes in vivo. Des cultures cellulaires et des greffes m’ont également permis de déterminer les propriétés des cellules de la NH, en particulier leur potentiel de différenciation et leur motilité. Enfin, j’ai utilisé des souris modifiées génétiquement afin de suivre les cellules progénitrices au cours du développement et étudier leur relation de lignage avec les pituicytes.

II. Résumé des résultats Mes résultats sont venus corroborer l’hypothèse de départ, comme l’illustre l’article 1 présenté ci-après. Tout d’abord, j’ai montré que des marqueurs d’OPC sont présents dans la NH en développement et ce, dès E20. Des hybridations in situ et des immunomarquages multiples ont ensuite permis de vérifier que des cellules de la NH expriment une combinaison de marqueurs caractéristiques des OPC (voir figure 19), à savoir olig1, Olig2, pdgfrα, sox10 et Nkx2.2.

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Figure 19 : Le lignage oligodendrocytaire

A. La spécification des précurseurs d’oligodendrocytes a lieu dans le neuroépithélium germinatif. Les OPC entament ensuite leur migration tout en proliférant. Ils deviennent ensuite postmitotiques et passent par des stades de pré-oligodendrocytes et d’oligodendrocytes immatures avant de se différencier en oligodendrocytes matures myélinisants. B. Ces étapes de maturation sont caractérisées par l’expression séquentielle de marqueurs distinctifs. Les OPC sont ainsi identifiables à des marqueurs comme pdgfrα, NG2 ou A2B5, qui disparaissent dans les stades plus avancés de l’oligodendrogenèse, ou d’autres qui persistent dans les oligodendrocytes matures, comme plp/dm20 et les facteurs de transcription Olig1, Olig2 et Sox10 (notons qu’Olig1 devient alors cytoplasmique). Note : ce schéma représente une synthèse de résultats obtenus in vitro et in vivo sur des cellules de différentes structures (nerf optique et moelle épinière notamment). Des divergences importantes peuvent exister dans d’autres régions du SNC. Tiré de Woodruff et al. 2001; Liu et al. 2002; Watanabe et al. 2004; Kitada & Rowitch 2006 Pour confirmer que les cellules ainsi identifiées d’après l’expression de marqueurs sont effectivement des OPC, j’ai étudié leurs propriétés fonctionnelles in vitro. Les travaux de Raff et ses collaborateurs avaient montré que les OPC du nerf optique présentent deux caractéristiques principales : d’une part, ils migrent en réponse à des facteurs spécifiques et, 51

d’autre part, ils sont bipotentiels, c’est-à-dire capables de se différencier soit en oligodendrocytes, soit en astrocytes de type 2, selon le milieu de culture (Raff et al. 1983b). J’ai d’abord étudié la motilité des cellules de la NH en utilisant des cultures d’explants de NH néonatale. J’ai observé que des cellules migrent hors des explants mais uniquement en présence de FGF-2, de PDGF-AA et de NT3, des facteurs favorisant notamment la migration des OPC du nerf optique (McKinnon et al. 1990; Barres et al. 1994). De plus, ces cellules sorties des explants expriment les marqueurs d’OPC Olig2, A2B5 et NG2. Ensuite, j’ai analysé le potentiel de différenciation des cellules de la NH : j’ai isolé les progéniteurs A2B5+ par tri cellulaire magnétique, puis les ai mis en culture dans différents milieux. Après 4 jours, les cellules A2B5+ maintenues dans un milieu pauvre en sérum se sont essentiellement différenciées en cellules O4+/GFAP- avec la morphologie ramifiée des oligodendrocytes matures, tandis que, dans un milieu contenant 10% de sérum, elles ont généré une majorité d’astrocytes de type 2 immunopositifs pour O4 et GFAP. En d’autres termes, les progéniteurs A2B5+ de la NH néonatale sont bipotentiels in vitro, comme les OPC du nerf optique. Ainsi, j’ai montré que la NH néonatale contient de véritables OPC. Cette découverte était surprenante puisqu’il n’y a aucun oligodendrocyte myélinisant dans la NH adulte, comme en témoigne un marquage négatif contre la protéine basique de la myéline (MBP). J’ai voulu confirmer que des cellules de la NH peuvent réellement donner naissance à des oligodendrocytes matures. En premier lieu, j’ai suivi la différenciation des cellules issues des explants de NH après 14 jours dans un milieu pauvre en sérum : telles des oligodendrocytes, elles se sont mises à exprimer O4, GalC et MBP. En second lieu, un membre de mon équipe a effectué des greffes de NH de souris actine-GFP dans le cerveau de souris shiverer déficientes en myéline : 25 et 39 jours plus tard, nous avons observé des cellules GFP+/MBP+, indiquant que des cellules de la NH s’étaient différenciées en oligodendrocytes myélinisants. Puisque la NH est dépourvue d’oligodendrocytes, quel peut être le rôle des OPC présents dans la NH périnatale ? Nous avons postulé qu’ils servent à générer non pas des oligodendrocytes, mais des pituicytes. En accord avec cette hypothèse, les marqueurs de pituicytes S100 et vimentine apparaissent vers le jour de la naissance (P0), donc après les OPC. A ce stade, de rares cellules expriment à la fois des marqueurs d’OPC (NG2) et de pituicyte (S100 ou vimentine) et pourraient ainsi représenter une étape de transition entre l’OPC et le pituicyte. Enfin, pour suivre le devenir des OPC au cours du développement de la NH, j’ai utilisé des souris modifiées génétiquement, chez lesquelles un gène rapporteur (lacZ) est exprimé dans toutes les cellules olig1+, notamment les OPC, ainsi que dans la 52

descendance de ces cellules (voir figure 20). Si les pituicytes dérivent des OPC olig1+, le gène lacZ doit se retrouver exprimé dans les pituicytes. C’est effectivement ce que j’ai observé après un marquage XGal sur des NH à P0 ou adultes : de nombreuses cellules de la NH sont XGal+, dont des pituicytes S100+ ou vimentine+, ce qui montre la relation de lignage qui existe entre les OPC olig1+ et les pituicytes. Figure 20 : Analyse du lignage des pituicytes grâce à des souris olig1-cre/RosaLacZ

Des souris olig1-cre hétérozygotes (1) (Lu et al. 2002) ont été croisées à une lignée Rosa26 (2) (Soriano 1999) portant un allèle de lacZ précédé d’une séquence STOP floxée. Chez les souris doublement hétérozygotes issues de ce croisement (3), toutes les cellules olig1+ expriment la recombinase Cre et donc toutes ces cellules et leur descendance activent la βgalactosidase de façon irréversible. Ainsi, ce système permet de suivre le devenir des précurseurs d’oligodendrocytes (olig1+) et notamment de déterminer s’ils génèrent des pituicytes dans la NH. Si cette hypothèse de lignage est vraie, les pituicytes doivent exprimer la β-galactosidase chez les souris olig1cre/RosaLacZ. Points-clés -

Des cellules de la NH périnatale expriment une combinaison de marqueurs d’OPC.

-

En culture et après transplantation, ces cellules présentent des caractéristiques fonctionnelles d’OPC.

-

Ces OPC génèrent les pituicytes au cours du développement de la NH. Les pituicytes peuvent donc être considérés comme une branche particulière du lignage oligodendrocytaire.

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GLIA 53:294–303 (2006)

Oligodendrocyte Precursor Cells Generate Pituicytes In Vivo During Neurohypophysis Development ISABELLE VIRARD,1 DELPHINE COQUILLAT,1 MIRCEA BANCILA,1 SOVANN KAING,2 AND PASCALE DURBEC1* 1 Laboratoire de Neurogene`se et Morphogene`se dans le Developpement et chez l’Adulte, CNRS UMR 6156, Universite de la Mediterranee, IBDM, Parc Scientifique de Luminy, Marseille, France 2 Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, Massachusetts

KEY WORDS oligodendrocyte precursor cell; pituicyte; neurohypophysis; cell lineage; cell differentiation

ABSTRACT In the vertebrate brain, much remains to be understood concerning the origin of glial cell diversity and the potential lineage relationships between the various types of glia. Besides astrocytes and myelin-forming oligodendrocytes, other macroglial cell populations are found in discrete areas of the central nervous system (CNS). They share functional features with astrocytes and oligodendrocytes but also display specific characteristics. Such specialized cells, called pituicytes, are located in the neurohypophysis (NH). Our work focuses on the lineage of the pituicytes during rodent development. First, we show that cells identified with a combination of oligodendrocyte precursor cell (OPC) markers are present in the developing rat NH. In culture, neonatal NH progenitors also share major functional characteristics with OPCs, being both migratory and bipotential, i.e. able to give rise to type 2 astrocytes and oligodendrocytes. We then observe that, either in vitro or after transplantation into myelin-deficient Shiverer brain, pieces of NH generate myelinating oligodendrocytes, confirming the oligodendrogenic potentiality of NH cells. However, no mature oligodendrocyte can be found in the NH. This led us to hypothesize that the OPCs present in the developing NH might be generating other glial cells, especially the pituicytes. Consistent with this hypothesis, the OPCs appear during NH development before pituicytes differentiate. Finally, we establish a lineage relationship between olig11 cells, most likely OPCs, and the pituicytes by fate-mapping experiments using genetically engineered mice. This constitutes the first demonstration that OPCs generate glial cells other than oligodendrocytes in vivo. C 2005 V

Wiley-Liss, Inc.

INTRODUCTION Although recent work has partly elucidated the development of oligodendrocytes in the neural tube (Liu et al., 2002; Rowitch, 2004), much remains to be discovered concerning other glial lineages in the rest of the CNS. Our study is aimed at understanding the origin of glial cells in the neurohypophysis (NH), a CNS structure located at the base of the brain (Fig. 1A–D). It is a model of special interest due to its relatively simple cellular composition: apart from axons, blood vessels and microglia, the principal cellular element is the pituicyte. C V

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Pituicytes are frequently regarded as astroglial cells since, in rat, they express vimentin (Marin et al., 1989) and S-100b (Cocchia and Miani, 1980), two markers of the astrocyte lineage. Glial fibrillary acidic protein (GFAP), another astrocyte marker, is also detected in rat and human pituicytes (Salm et al., 1982; Velasco et al., 1982), but not in mouse pituicytes (our unpublished observation). Pituicytes may thus constitute a specialized population of glial cells distinct from astrocytes, as anticipated from classical histological studies (Bucy, 1932). Importantly, no markers of mature oligodendrocytes are detected in the NH (see Fig. 4A). Nevertheless, an earlier study (Wang et al., 1994) suggested the presence of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in the developing NH: neurohypophysial explants from newborn rats generated migrating cells that exhibited properties similar to those described previously for OPCs from the optic nerve (Raff et al., 1983). During development, OPCs arise from multipotential cells in spatially restricted regions of the germinal zones (Spassky et al., 1998, 2001; Vallstedt et al., 2005). Subsequently, they migrate throughout the CNS to reach their final destinations, where most differentiate into oligodendrocytes, while others persist as OPCs in the adult. Early OPCs express characteristic markers: the proteolipid protein transcripts plp/dm20 (Spassky et al., 1998), which encode major myelin components; the platelet-derived growth factor receptor-a (PDGFRa) (Hall et al., 1996); Sox10, a transcription factor of the high-mobility group domain family, expressed by all glial progenitors (Kuhlbrodt et al., 1998; Zhou et al., 2000); Olig1 and Olig2, two bHLH transcription factors, necessary for early commitment of OPCs and oligodendrocyte lineage specification (Lu et al., 2000; Zhou et al., 2000); Nkx2.2, a homeodomain transcription factor involved in OPC differentiation (Qi

Grant sponsor: Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC); Grant sponsor: European Community; Grant number: QLG3-CT-2000-00911; Grant sponsor: INSERM Stem Cell Network. *Correspondence to: Pascale Durbec, Laboratoire de Neurogene`se et Morphogene`se dans le Developpement et chez l’Adulte, CNRS UMR 6156, Universite de la Mediterranee, IBDM, Parc Scientifique de Luminy, 13288 Marseille Cedex 9, France. Email: [email protected] Received 2 May 2005; Accepted 12 August 2005 DOI 10.1002/glia.20282 Published online 1 November 2005 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley. com).

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Fig. 1. Chronology of appearance of oligodendrocyte progenitor markers in the developing rat NH. A,C: The hypophysis is located under the brain. Boxes: areas viewed in B and D. B,D: Nissl staining on sagittal sections of E20 and P10 rat hypophysis. NH: neurohypophysis; I: intermediate lobe; AH: adenohypophysis. The pituitary stalk joins the NH to the hypothalamus (Hy). E: At E20, pdgfra1 cells are present throughout the NH (surrounded by the dotted line; inset: larger view of positive cells), where they persist at P0 (F), P10 (G), and in the adult (H). olig11 cells are detected in the NH at E20 (I), but not at its distal end, which is even more noticeable at P0 (J). At P10 (K) and in the adult (L), olig11 cells are restricted to the junction with the pituitary stalk. With the sox10 (M–P) and olig2 (Q–T) probes, we obtain staining patterns quite similar to that of olig1, although somewhat fainter for olig2. In the adult, sox101 cells are present throughout the NH (P). plp/dm20 is not detected at E20 (U), but later (V–X) displays a pattern of expression similar to olig1. Cx, cortex; Cb, cerebellum; OB, olfactory bulb; OC, optic chiasma. Scale bars 5 500 lm in B,D; 250 lm in E–X.

et al., 2001); NG2, a chondroitin sulfate proteoglycan (Nishiyama et al., 1996) and a surface antigen recognized exclusively in vitro by the A2B5 antibody (Raff et al., 1983). Culture of perinatal OPCs from structures such as the optic nerve demonstrated their bipotentiality in vitro: they differentiate into type 2 astrocytes in the presence of fetal calf serum (FCS) and cytokines (Fulton et al., 1991), whereas in serum-free medium they generate oligodendrocytes (Raff et al., 1983; Noble and Wolswijk, 1992; Noble et al., 2004). Other reports suggested that OPCs might actually be bipotential in vivo in pathological situations (reviewed in Franklin and Blakemore, 1995; Franklin, 2002). However, while it is clear that the primary fate of OPCs during CNS development is to generate oligodendrocytes, there is no definitive evidence that they give rise to astrocytes or other

glial cells in vivo (Skoff, 1990; Fulton et al., 1992; Franklin and Blakemore, 1995; Franklin, 2002; Noble et al., 2004). In the present work, we further characterize the cells previously identified as putative OPCs in the developing NH (Wang et al., 1994) and study their relationship with pituicytes. By in situ hybridization, immunolabeling, cell culture, and transplantation, we establish that cells with phenotypic and functional properties of OPCs are present in the developing rodent NH before pituicyte differentiation. Moreover, using genetically engineered mice to follow the fate of these precursors, we demonstrate in vivo that pituicytes derive from these OPCs. We conclude that OPCs generate pituicytes during NH development. This is the first demonstration that OPCs actually give rise to a glial cell population distinct from oligodendrocytes in vivo.

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MATERIALS AND METHODS Solutions for cell culture were purchased from Invitrogen (Cergy Pontoise, France) and other chemicals from Sigma (Saint Quentin Fallavier, France), if not otherwise specified.

Animals and Tissue Processing All procedures involving the use of animals were performed in accordance with the European Animal Care Guidelines and Directives. We used Wistar rat and Swiss mouse embryos and pups from embryonic day 16 (E16) to postnatal day 10 (P10), and 6- to 8-week-old males. Dr. D. Rowitch’s laboratory (Dana-Farber Cancer Institute) provided tissues from the progeny of an olig1cre heterozygote mouse (Lu et al., 2002) mated to a ROSA26 strain carrying a floxed-STOP allele of lacZ (Soriano, 1999). Shiverer mice were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Brains and hypophyses from animals perfused with 4% paraformaldehyde (PF) were postfixed with 4% PF for 2 h, cryoprotected, and included in OCT (Sakura Finetek, Bayer Diagnostic). Cryostat sections (12 lm) were collected on SuperFrost slides (VWR, Fontenay-sous-Bois, France).

Neurohypophysial Explant Cultures NH culture was performed as described by Wang and colleagues (1994). Briefly, NHs from P0–P3 rats were carefully dissected from the meninges, adenohypophysis, and intermediate lobe. Each was then sectioned into 4–6 pieces and explanted onto poly-L-lysine-treated glass coverslips either in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% FCS or in serum-free medium (DMEM-F12 complemented with 100 lg/ml human transferrin, 5 lg/ml insulin, 100 lM putrescin, 20 nM progesterone, 30 nM sodium selenite, and 1 mM sodium pyruvate) supplemented or not with FGF-2 (10 ng/ml), PDGF-AA (10 ng/ ml), and NT3 (10 ng/ml) in the presence of 0.4% methylcellulose. For cell migration assays, A2B51 cells were counted around NH explants in three independent experiments with at least five explants per condition. In experiments designed to analyze the role of proliferation, 10 mM b-D-arabinofuranosylcytosine (ARA-C) was added to the culture medium after 17 h. Cell progression out of the explants was then monitored at different time points (17, 23, and 39 h after explantation) using a Leica DM IRB inverted microscope.

Dissociated and Sorted Cell Cultures P0–P3 rat NHs were dissected, incubated in 5 mg/ml trypsin in Hanks’ balanced salt solution (HBSS) and dissociated by trituration. After rinsing in DMEM containing 10% FCS, the suspension was incubated with the A2B5 antibody (ascites diluted 1:100; American Type

Cell Collection [ATCC], Manassas, VA), then with an anti-mouse IgM antibody conjugated to microbeads (Miltenyi Biotec, Paris, France). Magnetic-activated cell sorting (MACS) was performed according to the manufacturer’s recommendations by passing the cells over an MS cell separation column (Miltenyi Biotec) twice. First, to confirm the identity of the acutely dissociated A2B51 cells, their antigenic phenotype was assayed by rapid centrifugation onto glass slides using a Shandon 4 Cytospin (Thermo, Jouan, Saint-Herblain, France) and by fixation and staining with A2B5 or the anti-Olig2 antibody. Second, to study their differentiation potential, the positive cell fraction was seeded at a concentration of 4,000 cells in 12 ll of DMEM complemented with 10% FCS onto poly-L-lysine-treated glass coverslips and left to settle for 1 h. We then filled the dishes with either DMEM complemented with 10% FCS or the defined medium described above, diluting the serum down to a final concentration of 1%. Both explant and dissociated cell cultures were kept at 37°C in 5% CO2 and 95% air, and one-half of the medium was changed every other day.

Transplantation of Mouse NH Pieces into Shiverer Brain We dissected NH pieces (150–200 lm in diameter) from newborn mice expressing the green fluorescent protein (GFP) under the control of the actin promoter (actin-GFP mice) (Hadjantonakis et al., 1998). We excluded the intermediate lobe and pituitary stalk and only used the part of the NH most distal from the stalk. We then grafted 2–3 NH pieces into the brain of 2-month-old myelin-deficient Shiverer mice (n 5 6) (Lachapelle et al., 1983–1984), within the lateral ventricle. We sacrificed host mice at various times after transplantation (25 or 39 days) and processed their brains for cryostat sectioning, as described above. Sagittal sections (14 lm) were labeled with an anti-MBP antibody. Immunolabeling and Nissl and XGal Staining We used the following primary antibodies: A2B5 (mouse IgM; pure supernatant; ATCC), anti-Olig2 (rabbit; 1:20,000; gift from Dr. Rowitch), polyclonal anti-NG2 (rabbit; 1:200–1:1,000; Chemicon, Euromedex, Mundolsheim, France), monoclonal anti-NG2 (mouse IgG; 1:25; Chemicon, Euromedex) and anti-Nkx2.2 (mouse IgG; 1:800; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, IA) for OPCs; O4 (mouse IgM; 1:1; ATCC) for oligodendrocytes and type 2 astrocytes; anti-MBP (mouse IgG; 1:50; Euromedex) and GalC (mouse IgG; 1:1; ATCC) for oligodendrocytes; and antivimentin (clone LN-6; mouse IgM; 1:200; Sigma), anti-S100 (rabbit; 1:300; DAKO, Trappes, France), monoclonal anti-GFAP (mouse IgG; 1:400; Sigma), and polyclonal anti-GFAP (rabbit; 1:100; Sigma) for pituicytes or astrocytes. For immunolabeling, the tissue sections were

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incubated overnight at 4°C in a primary antibody solution, with 0.1% Triton X-100 for internal markers (GFAP, MBP, Nkx2.2, Olig2, S-100, vimentin). The sections were subsequently washed and incubated with the appropriate fluorescently labeled secondary antibodies (1:1,000; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). To label cultures, we first fixed them for 10 min in 4% PF in phosphate-buffered saline (PBS) and incubated them in the primary antibody for 1 h at room temperature (RT); then, after washes, we soaked them in the corresponding secondary antibody for 1 h at RT. When necessary, we stained cell nuclei with Hoechst 33342. Sections, tissue pieces, and cultures were examined using Zeiss Axiophot fluorescence or confocal microscopes. Nissl and XGal stainings on 12-lm cryosections were performed using classical protocols. To carry out immunohistochemistry after either in situ hybridization or XGal staining, we postfixed the tissue sections with 4% PF and followed the immunohistochemical staining protocol of the Vectastain universal Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). To analyze the glial cells of the adult NH, the number of positive cells for a given marker was counted on at least 5 randomly-chosen sections from adult rat NH and compared with the total number of cells identified with the nuclear marker. When XGal staining was followed by immunohistochemistry, we first counted cells stained with XGal and then performed immunohistochemistry, analyzed the exact same fields, and included in our analysis only cells with a clear immunolabeling.

In Situ Hybridization on Sections Nonradioactive in situ hybridization was done as previously described (Tiveron et al., 1996), with minor modifications. Cryosections (12 lm) of adult rat NH were hybridized with 500 ng/ml digoxigenin-labeled antisense riboprobes for olig1 and olig2 (Lu et al., 2000), pdgfra (Mudhar et al., 1993), sox10 (Kuhlbrodt et al., 1998), or plp/dm20 (Peyron et al., 1997). To improve final color development, 5–10% polyvinyl alcohol was added to the development solution.

RESULTS Glial Progenitor Markers Are Present in the Developing Rat NH To determine whether there are OPCs in the NH, as had been previously suggested (Wang et al., 1994), we performed in situ hybridization with different classical glial markers on developing and adult rat NH. At early stages, OPCs can be identified by the expression of markers such as plp/dm20 (Spassky et al., 1998), plateletderived growth factor receptor a (PDGFRa) (Hall et al., 1996), and the transcription factors Sox10 (Kuhlbrodt et al., 1998; Zhou et al., 2000), Olig1, and Olig2 (Lu et al., 2000; Zhou et al., 2000). In rat, the anlage of the NH is formed before E17.5 as a mass of cells derived

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from the neuroectoderm. Ultrastructural studies had suggested that cell differentiation in the NH starts from E17.5 and is maintained till one month after birth (Galabov and Schiebler, 1978). In our study, we used tissue sections from E16 to adult rats to investigate the chronology in which glial progenitor markers appear during NH development (Fig. 1). The earliest detection of OPC markers in the anlage of the NH (Fig. 1A,B) was at E20; at this stage, we observed expression of pdgfra (Fig. 1E), olig1 (Fig. 1I), sox10 (Fig. 1M), only weak staining for olig2 (Fig. 1Q) and no staining for plp/dm20 (Fig. 1U). At P0, pdgfra was expressed in cells dispersed throughout the NH (Fig. 1F), while olig1-expressing cells were seen in the stalk and the proximal half of the NH (Fig. 1J). sox10 (Fig. 1N), olig2 (Fig. 1R), and plp/dm20 (Fig. 1V) probes had expression patterns similar to olig1. At later stages, namely at P10 (Fig. 1C,D) and in the adult, pdgfra (Fig. 1G,H) remained expressed in cells located in the entire NH, whereas olig1 (Fig. 1K,L), olig2 (Fig. 1S,T), and plp/dm20 (Fig. 1W,X) were only detected at the junction with the pituitary stalk. With the sox10 probe, at P10, we obtained a clear staining in the stalk and proximal part of the NH as well as in a few cells at the distal end of the NH (Fig. 1O) and, in the adult, a weak staining in cells dispersed throughout the NH (Fig. 1P). To characterize further the cells expressing OPC markers, we carried out double stainings at P0. At this stage, 100% of the olig11 cells in the NH also expressed Olig2 and vice versa (Fig. 2A). Furthermore, all the Olig21 cells were also positive for pdgfra (Fig. 2B) and sox10 (Fig. 2C), as well as for Nkx2.2 (Fig. 2D), another OPC marker (Qi et al., 2001). Thus, at P0, cells in the NH simultaneously, express olig1, Olig2, pdgfra, sox10, and Nkx2.2 a combination of markers also found in OPCs (Liu et al., 2002). Strikingly, the appearance of these cells coincided with the presence of migrating OPCs in the nearby optic chiasma (Fig. 2E,F) (Small et al., 1987). Overall these results demonstrate that progenitor cells expressing concomitantly a set of OPC markers, i.e., olig1/Olig2/pdgfra/sox10/Nkx2.2 are present in the developing NH. To establish that these progenitors are actual OPCs, we also characterized these cells functionally in vitro.

NH Precursors Are Migratory and Bipotential Previous studies showed that OPCs from the optic nerve display two major functional properties in vitro: they are migratory and bipotential, giving rise either to oligodendrocytes or to type 2 astrocytes, depending on the culture medium composition (Raff et al., 1983). Therefore, we first assayed the migratory behavior of NH cells. Newborn NHs were dissected out and cultured in defined medium in the presence of FGF-2, PDGF-AA, and NT3, known to favor the migration, proliferation, and survival of optic nerve OPCs (McKinnon et al., 1990; Barres et al., 1994). Migrating cells were observed around the explants within 24 h when FGF-2, PDGF-

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Fig. 2. Phenotypic characterization of rat NH glial progenitor cells at P0. In situ hybridizations combined with an anti-Olig2 staining demonstrate that the Olig21 cells in the NH are also positive for olig1 (A), pdgfra (B), and sox10 (C). D: Olig21 cells co-express Nkx2.2 as well, as seen by a double immunofluorescent staining. Thus, at P0, cells in the NH express a combination of markers characteristic of OPCs. E: Location of the area shown in F. F: Interestingly, olig11 cells are present in the NH at a time when olig11 OPCs enter the nearby optic chiasma (OC). Scale bars 5 20 lm in A–D; 500 lm in F.

AA, and NT3 were present in the medium. Cell migration also occurred in the presence of the antimitotic agent ARA-C (Fig. 3A–C), indicating that this effect was not due to proliferation. It did not result from explant spreading either since the explants maintained their original shape over time (Fig. 3A–C). The migrating cells were identified using Olig2 as well as NG2 and A2B5, classical in vitro markers for OPCs. We quantified the number of A2B51 cells around the explants after 48 h in the absence or presence of the trophic factors: only rare A2B51 cells were found in the control conditions (