Éloïc COLOMBO Prs Éric Marsault & Richard Leduc
Séminaire didactique 2 au doctorat 13 Novembre 2013
Bref historique • 1982, gène Int 1 actif chez les souris proto-congène. • 1987, Int 1 est identique au gène Wingless chez la Drosophile.
• 1989, Wingless impliqué développement embryonnaire.
• 1995, Prix Nobel en physiologie et Médecine Prfs Nüsselein-Volhard, Wieschaus et Lewis.
• 1996, Découverte de protéines clés dans la voie Wnt: -TCF/LEF (effecteurs nucléaires) -Frizzled (récepteurs) -LRP (co-récepteurs) 2
La protéine Wnt • Le nom Wnt est la réunion de Wg (wingless, en français « sans aile ») et Int 1 (intégration site 1). • Famille de glycoprotéines secrétées dans le milieu extracellulaire.
• Génome humain composé de 19 gènes Wnt numérotés (Wnt1…).
• Hautement conservée chez différentes espèces : souris, humains, xénope, la drosophile, poisson zèbre…
• L’embryogénèse, le système hématopoïétique et l’homéostasie de tissus humains. 3
Biogenèse et sécrétion de Wnt 3
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1 ______________ Clevers et al. Cells. 2012.
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Voies de signalisation de Wnt
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Rôles physiologiques
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Rôles physiopathologiques
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Voie canonique Wnt/b-caténine
Ub: Ubiquitine b-Trcp:b-transducin repeat containing protein TCF:T-cell factor ______________ Klaus et al. Nature Review. 2008.
Dvl: Dishevelled CKI: Casein kinase 1 APC: Adenomatous polyposis coli gene product GSK3: Glycogene synthase kinase 3
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Voie canonique Wnt/b-caténine
? ______________ Klaus et al. Nature Review. 2008.
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Projet de recherche
Le développement d’outils moléculaires serait une approche pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’activation de la voie de signalisation Wnt/b-caténine
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Objectifs Objectif 1: Identifier de petites molécules activant la voie Wnt/b-caténine. Objectif 2: Identifier la ou les cible(s) potentielle(s) de HLY78. Objectif 3: Effet de HLY78 sur l’interaction Axin-LRP6 et la phosphorylation de LRP6. Objectif 4: Effet de HLY78 sur le système hématopoïétique.
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Objectifs Objectif 1: Identifier de petites molécules activant la voie Wnt/b-caténine. Objectif 2: Identifier la ou les cible(s) potentielle(s) de HLY78. Objectif 3: Effet de HLY78 sur l’interaction Axin-LRP6 et la phosphorylation de LRP6. Objectif 4: Effet de HLY78 sur le système hématopoïétique.
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Criblage de dérivés Lycorine • •
Alcaloïde extrait de la famille des Amaryllidaceae. Activité anti-tumorale (effet cytostatique).
• • • •
Cellules HEK293T, plasmides TOPFlash, 1 h d’incubation avec 200 dérivés lycorine (10 µM). 6 h d’incubation avec DMSO ou Wnt3a + derivés lycorine. Activité luciférase.
Lycorine
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HLY78 active la voie Wnt/b-caténine • • • •
Cellules HEK293T, plasmide TOPFlash. 1 h d’incubation avec HLY78. 6 h d’incubation avec DMSO ou Wnt3a + HLY78. Activité luciférase.
HLY78 active de façon concentrationdépendante la voie Wnt/b-caténine en présence du ligand Wnt3a
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HLY78 active sélectivement la voie Wnt/b-caténine • • • • •
Cellules HEK293T, plasmides NFAT-Luc, SRF-Luc ou NF-kB-Luc. 1 h d’incubation avec HLY78. 6 h d’incubation avec DMSO ou Ionomycin, Serum, TNF-a + HLY78. Activité luciférase.
HLY78 active de façon concentrationdépendante et sélectivement la voie Wnt/b-caténine en présence de Wnt3a
NFAT: Nuclear factor activated T-cells SRF: Serum response factor NF-Kb: Nuclear factor- Kappa B
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Voie canonique Wnt/b-caténine
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Effet de HLY78 sur le niveau de la b-caténine • •
Cellules HEK293T prétraitées 1h avec HLY78 ou DMSO. 3 h d’incubation avec du DMSO, Wtn3a + HLY78.
HLY78 augmente le niveau de bcaténine dans le cytosol et le noyau
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Effet de HLY78 sur l’expression des gènes cibles de Wnt • • •
Cellules HEK293T, plasmide TOPFlash. 1 h d’incubation avec HLY78. 6 h d’incubation avec DMSO ou Wnt3a + HLY78. ______________ Klaus et al. Nature Review. 2008.
HLY78 augmente de manière concentrationdépendante l’expression des gènes de Wnt, Axin-2, DKK1, NKD1 en présence de Wnt3a
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Résumé
HLY78 est un activateur spécifique de la voie de signalisation Wnt/b-caténine en présence du ligand Wnt3a
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Objectifs Objectif 1: Identifier de petites molécules activant la transduction du signal Wnt/b-caténine. Objectif 2: Identifier la ou les cible(s) potentielle(s) de HLY78. Objectif 3: Effet de HLY78 sur l’interaction Axin-LRP6 et la phosphorylation de LRP6. Objectif 4: Effet de HLY78 sur le système hématopoïétique.
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HLY179 biotinylé active la voie Wnt/b-caténine • • • •
Cellules HEK293T, plasmides TOPFlash-luciférase. 1 h d’incubation avec 10 µM HLY78, biotine, HLY179…. 6 h d’incubation avec DMSO ou Wnt3a + HLY78….. Activité luciférase.
HLY179 biotinylé tout comme HLY78 active la voie Wnt/b-caténine en présence du Wnt3a
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Cible(s) potentielle(s) de HLY179 via une approche protéomique quantitative Biotine HLY179 biotinylé
Cellules HEK239T
Résine de streptavidin HLY78
Protéines X, Y
Protéine Y: Axin
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Essais Pulldown A
GST E.coli
Particule de Glutathione
GP
B C GP
Cellules HEK293T
GP
A
GST
GST
B
ou
A C
Anti-A
C
A C
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Interaction HLY179 biotinylé avec la protéine Axin •
Cellules HEK293T traitées avec HLY179 (10 µM) ou biotine.
La protéine Axin de la voie Wnt/b-caténine est une cible de HLY179
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Interaction spécifique HLY179 biotinylé avec la protéine Axin • • .
Cellules HEK293T, Axin et plasmides. 24 h d’incubation avec HLY179 ou biotine.
______________ Li et al. Cell. 2012.
HLY179 interagit spécifiquement avec la protéine Axin
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HLY78 et HLY179 ciblent la protéine Axin Romond et al. J.Cell. Sci. 2012.
• • • .
Protéine recombinante DAX. 10 µM HLY179, Biotine. 40 µM HLY78, HSS49a .
HLY179 et HLY78 interagissent avec le domaine DAX de la protéine Axin
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Résumé
HLY78 cible spécifiquement la protéine Axin via son domaine DAX
______________ Romond et al. J.Cell. Sci. 2012.
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Voie canonique Wnt/b-caténine
HLY78 ______________ Klaus et al. Nature Review. 2008.
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Objectifs Objectif 1: Identifier de petites molécules activant la voie Wnt/b-caténine. Objectif 2: Identifier la ou les cibles potentielle(s) de HLY78. Objectif 3: Effet de HLY78 sur l’interaction Axin-LRP6 et la phosphorylation de LRP6.
Objectif 4: Effet de HLY78 sur le système hématopoïétique.
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Effet in vitro de HLY78 sur l’interaction de Axin-LRP6 • •
Cellules HEK293T, plasmides Axin-Flag… 24 h d’incubation avec 20 µM HLY78 ou DMSO.
HLY78 favorise l’interaction de Axin-LRP6
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Effet in cellulo de HLY78 sur l’interaction de Axin-LRP6 • • •
Cellules HEK293T, Flag-Axin et LRP6 endogène. 20 h d’incubation avec 20 µM HLY78 ou DMSO. 3 h d’incubation avec DMSO ou Wnt3a + HLY78. ______________ Li et al. Cell. 2012.
HLY78 favorise l’interaction de Axin-LRP6 dans un modèle cellulaire exprimant Axin à des niveaux endogènes
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Interaction Axin-LRP6
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Effet in vitro de HLY78 sur l’auto-inhibition de Axin • •
Cellules HEK293T, Flag-Axin, Axin-N2-Flag… 20 h d’incubation avec 20 µM HLY78 ou DMSO.
HLY78 empêche l’auto-inhibition de Axin et donc favorise son interaction avec LRP6
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Effet de HLY78 sur la phosphorylation de LRP6 • • •
Cellules HEK293T, LRP6 endogène. 1 h d’incubation avec HLY78. 30 min d’incubation avec DMSO ou Wnt3a + HLY78.
PR8 (H1N1)
HLY78 induit de manière concentration-dépendante et ligand Wnt3a dépendant la phosphorylation de LRP6
X31 (H3N2)
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Résumé HLY78 favorise l’interaction AxinLRP6 et augmente la phosphorylation de LRP6 via son interaction avec le domaine DAX de l’Axin
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Résumé
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Objectifs Objectif 1: Identifier de petites molécules activant la transduction du signal Wnt/b-caténine. Objectif 2: Identifier la ou les cible(s) potentielle(s) de HLY78. Objectif 3: Effet de HLY78 sur l’interaction Axin-LRP6 et la phosphorylation de LRP6. Objectif 4: Effet de HLY78 sur le système hématopoïétique.
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Effet de HLY78 sur le développement du système hématopoïétique
HLY78 augmente l’expression des facteurs de transcriptions runx1 et cmyb des cellules souches hématopoïétiques
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Résumé
HLY78 est un régulateur positif sur le développement des cellules souches via l’augmentation de la voie de signalisation Wnt/b-caténine
______________ Li et al. Cell. 2012.
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Conclusions
HLY78 ______________ Klaus et al. Nature Review. 2008. 40
Perspective
HLY78 comme un activateur spécifique de la voie de signalisation Wnt présente une autre approche pour le traitement de l’ostéoporose.
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