Rencontres Scientifiques ANR-ANSES « Perturbateurs Endocriniens » 8 Juillet 2019, Paris
CONTRIBUTION À L’ÉVALUATION DE L’EXPOSITION DE L’HOMME AUX SUBSTITUTS ET DÉRIVÉS DU BISPHENOL A ET À LA CARACTÉRISATION DU DANGER ASSOCIÉ
ANR-13-CESA-0012-01 NEWPLAST Dr. Jean-Philippe Antignac Yoann Deceuninck, Emmanuelle Bichon, Ronan Cariou, Bruno Le Bizec Laboratoire d’Étude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) UMR Oniris-INRA 1329, CS 50707, 44307 Nantes Cedex 3, France - www.laberca.org
Objet et partenaires Un projet intégré pour anticiper/alimenter l’évaluation du risque
JP. Antignac
A. Berrebi
D. Zalko
B. Jegou
P. Balaguer 2
Substances cibles Une couverture étendue en termes de marqueurs d’exposition cibles
3
Objectifs Trois objectifs complémentaires, à l’échelle in-vivo, tissulaire, cellulaire et moléculaire Le BPA et ses substituts
1. Quelle exposition interne et quel transfert maternofœtal ? ~ 100 couples mères-nouveaux-nés
2. Quel impact toxicologique sur les cibles hépatique et testiculaire ?
Nouvelles données et connaissances relatives à la caractérisation de l’exposition et du danger associés aux bisphénols
Divers modèle cellulaires invitro et/ou explants ex-vivo
3. Quelles interactions avec les différents récepteurs nucléaires ?
4
Méthodologie Une famille de composé exigeante au plan analytique
Deceunink et al., Anal. Bioanal. Chem 2015;407:2485-2497.
5
0.0 15.2713.021
15.2713.046
15.1803.116
14.2709.016
15.835.001
15.1803.126
14.2709.026
14.2709.031
15.2713.056
15.1803.101
15.2713.061
15.1803.061
15.1803.021
15.1803.141
15.1803.176
15.2713.071
14.2709.071
15.1803.011
Sérum maternel
15.1803.046
15.1803.081
15.835.036
15.1803.106
15.835.056
15.1803.096
15.1803.026
15.2713.142
14.2709.032
15.835.082
14.2709.067
15.2713.052
14.2709.047
14.2709.062
15.835.042
15.2713.017
15.1803.147
15.2713.102
15.1803.092
15.2713.032
15.835.027
15.2713.012
15.1803.117
15.1803.022
15.1803.062
Sérum du cordon
15.2713.047
15.2713.082
15.835.052
15.1803.122
15.1803.052
15.1803.137
15.1803.012
15.835.068
14.2709.023
14.2709.053
15.2713.113
15.835.008
14.2709.068
15.835.083
15.2713.033
15.2713.028
15.835.078
15.2713.108
15.1803.033
15.2713.093
15.1803.153
15.1803.063
15.835.048
15.2713.003
15.2713.128
Blancs
15.2713.083
15.2713.063
15.1803.023
15.1803.158
15.1803.018
15.1803.053
15.1803.163
15.2713.138
blk24
blk4
blk6
blk8
blk14
blk11
BPA (ng/mL)
Résultats Aperçu global des niveaux de concentration observés en BPA
4.0
Lait maternel
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
µ+3s
6
Résultats Aperçu global des niveaux de concentration observés en BPA Med [Min-Max]
BPA (ng/mL)
4
0.53 [0.05-2.88]
0.46 [0.04-7.63]
0.13 [0.02-3.73]
2
Cord serum BPA in Cord Serum (ng/mL)
Detection rate 90% 6
2
1
0 0
0 Cord Serum
Maternal Serum
2
4
BPA in Maternal Serum (ng/mL
Milk
Mat. serum 6
Sample_Type
Cord serum
Mat. serum
Milk
3
2
1
0.2
0.4
0.6
BPA in Milk (ng/mL)
0.8
moy ± sem
0
0.0
BPA (ng/mL)
Milk
Cord Serum
Maternal Serum
Milk
Cord serum
Sample_Type Mat. serum
Milk
0
2
4
BPA in Maternal Serum (ng/mL
Mat. serum 6
7
0.0 15.835.053
15.835.021
14.2709.036
14.2709.041
15.2713.056
14.2709.016
15.2713.016
15.2713.146
15.2713.126
15.2713.036
15.1803.121
15.2713.051
15.835.001
15.1803.171
15.1803.036
15.1803.041
15.2713.001
15.1803.151
14.2709.071
Sérum maternel
15.835.076
15.2713.076
15.1803.081
14.2709.051
15.835.056
15.835.031
15.835.006
15.1803.082
15.1803.162
15.1803.172
15.1803.067
15.1803.077
15.2713.122
15.1803.107
15.835.057
14.2709.027
15.2713.077
15.2713.047
15.1803.022
14.2709.067
15.2713.097
15.2713.112
15.1803.007
15.2713.117
15.2713.062
Sérum du cordon
15.2713.012
15.2713.002
15.835.062
15.2713.017
15.835.042
15.835.017
15.1803.027
15.2713.123
15.1803.103
15.1803.163
15.1803.158
15.1803.053
15.835.058
15.1803.128
14.2709.063
15.2713.128
14.2709.028
15.1803.113
15.1803.188
14.2709.018
15.1803.088
15.835.008
15.2713.118
14.2709.048
15.2713.038
Blancs
15.835.028
15.1803.028
15.2713.018
15.1803.123
14.2709.058
15.2713.048
15.2713.003
blk22
blk4
blk3
blk18
blk16
blk17
BPS (ng/mL)
Résultats Aperçu global des niveaux de concentration observés en BPS
0.4
Lait maternel
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
0.1
8
Résultats Aperçu global des niveaux de concentration observés en BPS Med [Min-Max]
BPS (ng/mL)
0.3
0.02 [0.00-0.23]
0.02 [0.00-0.26]
0.02 [0.00-0.35]
0.2
0.1
Cord serum
0.20
BPS in Cord Serum (ng/mL)
Detection rate 80%
0.15
0.10
0.05
0.00
0.0
0.0
Cord Serum
Cord serum
Maternal Serum
Sample_Type
Mat. serum
0.000
0.010
0.020
BPS in Milk (ng/mL)
0.030
0.3
0.2
0.1
0.0
Cord Serum
Cord serum
Mat. serum
Milk
moy ± sem BPS (ng/mL)
0.2
BPS in Maternal Serum (ng/mL
Milk
Milk
0.1
Maternal Serum
Mat. serum Sample_Type
Milk
Milk
0.0
0.1
BPS in Maternal Serum (ng/mL
0.2
Mat. serum
9
blk7
0.0 15.835.022
15.2713.011
15.2713.116
15.1803.116
14.2709.046
15.1803.176
15.1803.031
15.1803.126
14.2709.066
14.2709.021
14.2709.011
15.2713.146
15.2713.106
15.2713.121
15.2713.141
15.1803.056
15.1803.011
14.2709.051
15.1803.161
BPF (ng/mL)
Sérum maternel
15.1803.151
14.2709.061
15.835.056
15.1803.086
15.2713.051
15.1803.106
15.1803.041
15.1803.177
14.2709.027
15.2713.092
15.1803.092
15.1803.062
15.835.021 15.835.011 15.835.031 15.1803.041 15.835.006 15.835.001 15.835.061 15.1803.106 15.1803.036 15.1803.051 15.2713.111 15.2713.051 15.835.076 15.1803.141 15.1803.081 15.1803.086 15.835.066 15.2713.096 15.1803.171 15.835.056 14.2709.071 15.835.046 15.1803.001 14.2709.061 15.835.041 15.1803.076 15.835.071 15.1803.151 15.1803.071 15.1803.156 15.1803.021 15.1803.161 15.1803.096 14.2709.041 15.835.026 14.2709.051 15.2713.001 15.1803.016 14.2709.056 15.1803.011 15.835.016 15.1803.046 15.1803.006 15.1803.056 15.835.036 15.835.051 15.2713.101 15.2713.141 15.1803.111 15.1803.061 15.2713.091 15.2713.121 15.835.081 15.2713.066 14.2709.026 15.2713.106 15.1803.026 15.1803.131 15.2713.081 15.2713.146 15.2713.076 15.1803.091 15.1803.101 14.2709.011 15.1803.136 15.1803.181 15.2713.086 14.2709.021 15.2713.056 15.1803.066 15.1803.121 14.2709.066 14.2709.016 15.2713.041 15.2713.126 15.1803.126 15.1803.146 15.2713.021 15.1803.166 15.1803.031 14.2709.031 15.2713.046 15.2713.071 15.1803.176 15.2713.061 14.2709.006 15.2713.131 14.2709.046 14.2709.036 15.2713.031 15.2713.036 15.1803.116 14.2709.001 15.2713.016 15.2713.026 15.2713.116 15.1803.186 15.2713.136 15.2713.006 15.2713.011
0.0
15.1803.072
14.2709.032
30.0
15.2713.112
15.1803.142
14.2709.002
15.2713.097
15.1803.007
15.2713.027
15.1803.102
15.835.042
15.1803.032
15.2713.007
15.1803.002
Sérum du cordon
15.835.077
15.2713.147
15.1803.052
15.1803.187
15.2713.132
15.2713.002
15.2713.108
15.1803.028
14.2709.028
15.1803.083
14.2709.038
14.2709.033
15.1803.183
15.2713.033
14.2709.058
15.1803.093
14.2709.003
15.2713.103
14.2709.008
15.1803.133
15.1803.048
15.1803.128
15.1803.043
15.2713.003
15.1803.063
Blancs
15.1803.148
15.2713.148
15.835.053
15.2713.133
15.1803.018
15.1803.163
15.2713.138
blk1
blk17
blk24
blk6
blk13
BPF (ng/mL)
Résultats Aperçu global des niveaux de concentration observés en BPF
70.0
Lait maternel
60.0
50.0
0.3
40.0 0.3
0.2
0.2
0.1
20.0 0.1
10.0
10
Résultats Aperçu global des niveaux de concentration observés en BPF
0.65 2.37 [0.02-62.94] [0.02-38.16]
0.01 [0.00-0.26]
BPF (ng/mL)
40
Med [Min-Max]
20
Cord serum BPF in Cord Serum (ng/mL)
Detection rate 95%
40
20
0
0
0
Cord Serum
Cord serum
Maternal Serum
Mat. serum Sample_Type
Mat. serum
30
Milk
5
moy ± sem
0.1
1
2
3
BPF in Milk (ng/mL)
4
0.2
0
BPF (ng/mL)
20
BPF in Maternal Serum (ng/mL
Milk
Milk
10
0.0
Cord Serum
Cord serum
Maternal Serum
Mat. serum Sample_Type
Milk
Milk
0
10
20
BPF in Maternal Serum (ng/mL
Mat. serum
30
11
Conclusions
• Premières données Françaises concernant les niveaux de BPA et substituts dans 3 matrices biologiques
• Niveaux d’exposition observés en BPS < BPA < BPF
• Déterminants des niveaux d’exposition observés restent à caractériser (notamment pour BPF)
• Effet levier du projet au plan national (programme de biosurveillance – cohorte ESTEBAN - SpF) et au plan EU (projet HBM4EU – organisation d’essais interlaboratoires BPA/S/F)
Call: H2020-SC1-2016-RTD “Human Biomonitoring for EU” 28 countries, >100 partners, 50 M€
12
Conclusions De nouvelles données concernant le métabolisme du BPS et du BADGE 7000
A
75%
6000
BPS-G
5000
dpm
4000
14% 3000
BPS
8,2%
2000
BPS-S
1000
0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
te m p s ( m in )
M ELN
Z E L H z fE R a
T 4 7 D -K B L u c
Z E L H z fE R b 2
H epG 2
B
Figure 6. Cinétique de formation du métabolite hydroxylé du BPS en fonction de la concentration de [3H]-BPS incubée avec des fractions microsomales hépatiques de rat (gauche) ou d’homme (centre)
2000
1500
M ic ro s o m e s f o ie H o m m e 0 ,2 m g / m L p r o t é i n e s - 1 0 m in i n c u b a t i o n
1000
150
0 0
50
100
150
200
[B P S ] µ M
Figure 5 : A) Radio-chromatogramme caractéristique du métabolisme du BPS sur lignées cellulaires humaines (ici : HepaRG, 24h, 150 µM BPS) montrant les deux métabolites majoritaires : le BPS glucuronide (BPS-G) et le BPS sulfate (BPS-S). B) Cinétique de métabolisation (globale : tous métabolites confondus) du BPS sur lignées cellulaires : HepG2, modèle hépatique, est une lignée métaboliquement compétente (Le Fol et al. 2016).
B A D G E M e t a b o lit e s
500
(n m o le s /m in /m g p ro té in e s )
6
( p m o l/h /1 0 c e ll)
v ite s s e d u m é ta b o lis m e t o t a l
2500
ZFL
Hom m e m ono
100
Fem m e m ono H om m e di Fem m e di
50
0 0
200
400
600
[ B A D G E ] (µ M )
Fig. 7 et 8. A gauche, radio-HPLC d’une incubation de [14C]-BADGE (100 µM, 4h) avec des microtranches de foie de rat : formation du BADGE mono-H2O et du BADGE di-H2O; A droite, formation de ces métabolites lors d’incubations réalisées avec des fractions microsomales hépatiques humaines.
13
Conclusions De nouvelles données concernant l’impact du BPS et du BADGE au niveau du métabolome hépatique et testiculaire
Model combining ESI+ and ESI-
Fig. 10. Analyse discriminante (PLS-DA) après analyse RMN du métabolome de cellules HepG2 exposées 24h à des concentrations de 0 (noir, contrôle), 10-6M (bleu), 10-9M (rouge) ou 10-12M (vert) de bisphénol S. Le modèle est valide et permet de discriminer l’ensemble des concentrations d’exposition des hépatocytes (R² = 57.8% et Q² = 0.454).
Good discrimination between control and treated samples
Treated samples – down regulated metabolites: O-acetylcarnitine ↓ Propionyl-L-carnitine ↓ 5-methyluridine ↓ 4-methyl-2-oxovaleric acid ↓ Riboflavin ↓ 2-deoxyuridine ↓ 2-hydroxy-3-methylbutiric acid ↓ 2-oxovaleric acid or 3-methyl-2-oxobutanoic acid ↓ Hypoxanthine ↓
Treated samples – up-regulated metabolites: Cytidine ↑ Fumaric acid ↑ Inosine ↑ Indolacetic acid ↑ L-glyceric acid ↑
Down regulated
RT: 0.08 - 16.13 100
NL: 4.55E7 TIC F: FTMS {1,1} - p ESI Full ms [100.00-2000.00] MS 20141118-001
80 60 40 20
NL: 7.35E6 m/z= 303.2316-303.2346 F: FTMS {1,1} - p ESI Full ms [100.00-2000.00] MS 20141118-001
100 80 60
Good discrimination between control and treated samples on the basis of the ESI- profiles, no significant discrimination from the ESI+ profiles
40
M303T161
C20:4
M305T196
C20:3
M327T144
C22:6
20 0 100
NL: 3.96E6 m/z= 305.2474-305.2504 F: FTMS {1,1} - p ESI Full ms [100.00-2000.00] MS 20141118-001
80 60 40 20 0 100
Some fatty acids identified as putative markers
Fig. 11. Analyse discriminante (PLS-DA) après analyse RMN du métabolome de cellules HepG2 exposées 24h à différentes concentrations de bisphénol A (BPA) ou de BADGE. En noir, les contrôles DMSO. Le modèle est robuste et valide (R2Y : 50% ; Q2 : 0.40). Un effet dose est également observé dans le cas du BPA.
80 60
NL: 6.56E6 m/z= 327.2316-327.2348 F: FTMS {1,1} - p ESI Full ms [100.00-2000.00] MS 20141118-001
40 20 0 1
2
3
4
5
6
7
8 9 Time (min)
10
11
12
13
14
15
16
T
C QC
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Rencontres Scientifiques ANR-ANSES « Perturbateurs Endocriniens » 8 Juillet 2019, Paris
CONTRIBUTION À L’ÉVALUATION DE L’EXPOSITION DE L’HOMME AUX SUBSTITUTS ET DÉRIVÉS DU BISPHENOL A ET À LA CARACTÉRISATION DU DANGER ASSOCIÉ
ANR-13-CESA-0012-01 NEWPLAST Dr. Jean-Philippe Antignac Yoann Deceuninck, Emmanuelle Bichon, Ronan Cariou, Bruno Le Bizec Laboratoire d’Étude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) USC INRA 1329, Oniris, LUNAM Université BP 50707, 44307 Nantes Cedex 3, France - www.laberca.org
