UNIVERSITE DE DROIT, D'ECONOMIE ET DES SCIENCES D'AIX-MARSEILLE (AIX-MARSEILLE III)

THESE présentée pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université de droit, d'économie et des sciences d'Aix-Marseille Discipline : Géosciences de l'Environnement Ecole doctorale : Sciences de l'Environnement : Système Terre

Biodisponibilité du cuivre dans la rhizosphère de différentes plantes cultivées. - Cas de sols viticoles contaminés par des fongicides -

Présentée et soutenue publiquement par

Valérie CHAIGNON

le 19 octobre 2001

Membres du jury M. Michel JAUZEIN M. Erik SMOLDERS M. Marc AMOURIC M. Marc BENEDETTI M. Michel MENCH M. Philippe HINSINGER

Professeur, Université H. Poincaré - Nancy I Rapporteur Professeur, Katholieke Universiteit Leuven – Belgique Rapporteur Professeur, Université Saint Jérôme - Aix-Marseille III Chargé de Recherche, CNRS Paris Directeur de Recherche, INRA Bordeaux Chargé de Recherche, INRA Montpellier Directeur de thèse 1

SOMMAIRE

Introduction

7

Chapitre I : Analyse bibliographique

9

I – 1. LE CUIVRE DANS LE SOL I – 1 1. Localisation et spéciation du cuivre dans le sol

9 9 9 9

Distribution du cuivre dans le profil de sol Spéciation et mobilité chimique du cuivre dans le sol Effets des propriétés physico-chimiques et des constituants du sol sur la spéciation du cuivre dans le sol 11

I – 2 1. Détermination de la spéciation du cuivre dans le sol

11 11 11

Méthodes physiques Méthodes chimiques

I - 1 3. Biodisponibilité du cuivre

16 16 17 18

Définition Evaluation de la biodisponibilité du cuivre dans les sols Biodisponibilité du cuivre dans les sols viticoles du Languedoc

I - 2. LE CUIVRE DANS LA PLANTE I - 2 1. Le cuivre, oligo-élément

19 19

I - 2 2. Absorption et rôles physiologiques du cuivre

20 20 21

Absorption du cuivre par la plante Rôle physiologique du cuivre dans la plante

I - 3. INTERACTION SOL-PLANTE : LA RHIZOSPHERE I - 3 1. Définition

21 21

I - 3 2. L'impact des activités racinaires dans la rhizosphère

22 22 23 24 24 27

Changement des concentrations ioniques dans la rhizosphère Changement de pH dans la rhizosphère Changement des conditions rédox de la rhizosphère Complexation des métaux dans la rhizosphère Micro-organismes dans la rhizosphère

I - 4. HYPOTHESES ET OBJECTIFS DE L’ETUDE I - 4 1. Hypothèses de travail

27 27

I - 4 2. Objectifs de l’étude

28 28 28 28

Premier objectif Deuxième objectif Démarche à suivre

2

Chapitre II : Matériel et méthodes

29

II – 1. LES SOLS II – 1 1. Présentation de la zone d'étude II – 1 2. Choix des parcelles et échantillonnages II – 1 3. Analyses des sols échantillonnés

29 29 30 31

II – 2. L'APPROCHE EXPERIMENTALE Introduction

32 32

‘A biotest for evaluating metal bioavailability to plants : application to coppercontaminated soils’ 36

Abstract

37

II – 2 1. Introduction

38

II – 2 2. Materials and methods

39 39 39 41 41 42

General principles of the proposed bioassay Hydroponic preculture Hydroponic experimen Soil experiment Analysis

II – 2 3. Results

43 44 45

Hydroponic experiment Soil experiment

II – 2 4. Discussion

50 50 51 52

Phytotoxicity of Cu for rape grown in the hydroponic experiment Phytotoxicity of Cu for rape grown in the soil experiment Selection of optimal conditions for the bioassay

II – 2 5. Conclusions

53

Acknowledgements References

54 54

II – 3. LES ESPECES VEGETALES Introduction

57 57

‘Phytotoxicity of Cu in a range of hydroponically grown plant species as assessed through various endpoints’ 58

Abstract

59

II – 3 1. Introduction

60

II – 3 2. Materials and methods

60 60 61

Bioassay Analyses

3

II – 3 3. Results

61 61 64 69 69

Shoot and root biomasses and Cu concentrations of wheat genotypes Shoot and root biomasses and Cu concentrations of ryegrass Shoot and root biomasses and Cu concentrations of tomato Changes in nutrient solution pH

II – 3 4. Discussion

69

II – 3 5. Conclusions

74

References

75

Chapitre III : Propriétés physico-chimiques du sol, spéciation et 77 biodisponibilité de Cu Introduction

77

‘Copper bioavailability and extractability as related to chemical properties of 78 contaminated soils from a vine-growing area’

Abstract

79

III – 1. INTRODUCTION

80

III – 2. MATERIALS AND METHODS III – 2 1. Soil samples III – 2 2. Chemical extraction procedures III – 2 3. Bioassay III – 2 4. Plant analyses III – 2 5. Statistical analyses

81 81 81 81 83 83

III – 3. RESULTS III – 3 1. Chemical extractability of soil Cu III – 3 2. Bioavailability of soil Cu to plants III – 3 3. Relationships between soil properties, soil Cu extractability and bioavailability

83 86 86

III – 4. DISCUSSION III – 4 1. Plant Cu concentration and bioavailability of soil Cu III – 4 2. Extractability and bioavailability of soil Cu III – 4 3. Soil properties and bioavailability of soil Cu

90 90 91 94

III – 5. CONCLUSIONS

95

Acknowledgements References

95 96

89

4

Chapitre IV : Variations du pH de la rhizosphère, extractabilité et biodisponibilité de Cu 99 Introduction

99

‘Copper bioavailability and rhizosphere pH changes as affected by nitrogen supply for 100 tomato and oilseed rape cropped on an acidic and a calcareous soil’

Abstract

101

IV – 1 1. Introduction

102

IV – 1 2. Materials and Methods

103 103 103 104 104

Soil characteristics Bioassay Plant analyses Soil chemical extraction procedures

IV – 1 3. Results Soil pH changes Biomasses of tomato and oilseed rape Concentration, bioavailability of Cu in plants and pH changes Chemical extractability of soil Cu

IV – 1 4. Discussion Root-induced pH changes Tomato and rape Cu concentration and biomasses Extractability of Cu and pH changes

104 104 106 106 109 111 111 112 113

IV – 1 5. Conclusions

113

Acknowledgements References

114 114

‘Rhizosphere pH, bioavailability and extractability of Cu in a Cu-contaminated acidic soil as affected by liming’ 117

Abstract

118

IV – 2 1. Introduction

119

IV – 2 2. Materials and Methods

120 120 120 121 121

Soil characteristics Bioassay Plant analyses Soil analyses

IV – 2 3. Results Soil and rhizosphere pH Biomasses and Cu concentrations in shoots and roots Soil and rhizosphere Cu extractability Relationships between pH, soil Cu extractability and bioavailability

122 122 122 126 127

5

IV – 2 4. Discussion Root-induced pH changes in the rhizosphere Copper extractability as affected by soil and rhizosphere pH Copper bioavailability as affected by soil and rhizosphere pH

127 127 129 130

IV – 2 5. Conclusions

131

Acknowledgements References

132 132

Chapitre V : Libération de phytosidérophores dans la rhizosphère et 135 biodisponibilité de Cu Introduction

135

‘Fe-deficiency increases Cu acquisition by wheat cropped in a Cu-contaminated, vineyard soil’ 136

Summary

137

V – 1. INTRODUCTION

138

V – 2. MATERIALS AND METHODS V – 2 1. Plant and soil characteristics V – 2 2. Bioassay-hydroponic stage V – 2 3. Bioassay-soil stage V – 2 4. Collection and quantification of root exudates (phytosiderophores) V – 2 5 . Plant and soil analyses

139 139 139 140 140 140

V – 3. RESULTS V – 3 1. Visual symptoms and growth V – 3 2. Root and shoot Cu concentrations V – 3 3. Plant Cu and soil Cu acquisition V – 3 4. Root and shoot concentration and acquisition of Zn and Fe from soil V – 3 5. Phytosiderophore (PS) release and rhizosphere pH changes

141 141 143 143 146 146

V – 4. DISCUSSION V – 4 1. Effect of Zn deficiency V – 4 2. Effect of Fe deficiency V – 4 3. Cu acquisition and phytotoxicity in calcareous soils

148 148 148 150

Acknowledgements References

152 152

Conclusions

155

Références bibliographiques

165 6

Introduction Au cours du XIXième siècle, un parasite (Plasmopara viticola) a envahi presque tout le vignoble français et la plupart des vignobles européens (Lafforgue, 1928). Cette maladie était déjà connue aux Etats-Unis où elle provoquait périodiquement des dégâts très importants, notamment sur les cépages européens introduits à plusieurs reprises dans les états de l'est. En quelques jours seulement, les feuilles se recouvraient de tâches jaunes qui se nécrosaient rapidement, laissant les viticulteurs complètement désarmés (Leguay, 1968). Le nom américain Mildew qui le désignait, devint Mildiou en français (Pouget, 1990). L'action préservatrice du cuivre sur le mildiou est apparue de manière fortuite. En Bourgogne, seuls les feuillages de vignes palissées en contact des échalas imprégnés de sulfate de cuivre (pour en prolonger la durée), étaient protégés du mildiou (Branas, 1984). Dans le bordelais, un ancien usage voulait que le feuillage des vignes en bordure de chemin soit recouvert d'un mélange de cuivre et de chaux pour en éloigner les maraudeurs. La persistance du feuillage ainsi traité et l'absence de mildiou sur ces feuilles ont été observées par Millardet en 1882 (Branas, 1984). A partir de 1895, l'utilisation du cuivre en viticulture pour lutter contre le mildiou s'est généralisée et des applications par pulvérisation sur le feuillage ont été systématiquement réalisées dans l'ensemble des régions viticoles de France (Branas, 1984). De nombreux mélanges à base de sels de cuivre ont alors été testés, aboutissant rapidement à la mise au point des bouillies connues actuellement. La bouillie bourguignonne, obtenue à partir de la neutralisation du sulfate de cuivre par du carbonate de sodium est peu stable, peu persistante et coûteuse. Elle a été peu à peu abandonnée dans la lutte contre le mildiou au profit de la bouillie bordelaise (Girard, 1997). La bouillie bordelaise est le résultat de la neutralisation d'une solution aqueuse de sulfate de cuivre (CuSO4, 5H2O) par du lait de chaux (Ca(OH)2) (Pouget, 1990). La composition exacte de la bouillie bordelaise reste souvent difficile à connaître, car la nature de ces constituants peut varier. On peut trouver du gypse ou du plâtre pour les composés calciques et de la devellite (CaSO4, Cu(OH)2, H2O), de la posnjakite (CuSO4, Cu(OH)2, H2O) ou de la bronchantite (CuSO4, Cu(OH)2) pour les composés cupriques. Ces différents sulfates sont des sels provenant du traitement du cuivre par l'acide sulfurique. En France, les bouillies bordelaises commercialisées contiennent 20 à 25 % de cuivre selon les spécialités (Girard, 1997). Le cuivre pulvérisé sur les feuilles de vigne est en grande partie insoluble. Il réagit avec le CO2 de l'eau de pluie pour former la malachite (CuCO3, Cu(OH)2), sel de cuivre soluble qui progressivement libère les ions cuivriques Cu2+ possédant des propriétés antifongiques et bactéricides. L'efficacité antifongique et bactéricide du cuivre, à titre préventif uniquement, intervient à plusieurs niveaux : le cuivre bloque les processus respiratoires, freine la biosynthèse des protéines et ralentit les transferts d'éléments en diminuant l'activité membranaire (Rousseau, 1995). Avant la seconde guerre mondiale, la consommation annuelle de sulfate de cuivre dans l'agriculture en France, s'élevait à 100 000 t par an (Branas, 1984). La pénurie de cuivre provoquée par la guerre a suscité dans tous les pays européens de multiples recherches visant à réduire les doses de cuivre utilisées en agriculture. A partir de 1945, des produits organiques de synthèse actifs contre le mildiou ont été découverts (zinèbe, manèbe, cymoxanil, métalxyl, phosetyl - Al…). Même si la plupart de ces fongicides sont associés au cuivre, la persistance et l'efficacité de ces produits restent souvent beaucoup plus faibles que celles de la bouillie bordelaise (Cluzeau, 1993). Depuis le milieu des années 1980, les traitements à base de cuivre sont à nouveau très utilisés principalement parce que leur abandon a entraîné la réapparition d'un certain nombre de maladies oubliées depuis plus d'un siècle (Cluzeau, 1993). Par ailleurs,

7

les sels de cuivre restent aujourd'hui les rares fongicides autorisés en agriculture biologique (Rousseau, 1995). L'utilisation de sels de cuivre sous forme de bouillie bordelaise comme moyen de lutte contre le mildiou est à l'origine de l'accumulation du métal constatée dans tous les sols de vignoble : environ 7 700 000 ha dans le monde, dont 3 500 000 ha dans l'Union Européenne et 920 000 ha en France (OIV-ONIVINS, 1995). En viticulture traditionnelle, la vigne subit quatre à cinq traitements comportant 10 à 12 kg de bouillie, soit 50 à 60 kg de sel cristallisé, correspondant à environ 14 kg ha-1 an-1 de métal. Cette dose est d'ailleurs fréquemment dépassée, le nombre de traitements étant porté à huit, dix et même quatorze pendant les années pluvieuses ou sur les terrains naturellement humides. Une partie du cuivre apporté à la vigne lors des pulvérisations de fongicides cupriques n’atteint pas la vigne elle-même. En effet, 60 à 70 % de cuivre pulvérisé se retrouvent sur les vignes, 20 à 30 % se retrouvent sur le sol et environ 10 % se retrouvent dans l’atmosphère, emportés par les vents. Le cuivre rejoint ensuite le sol soit par lessivage des feuilles et des ceps de vigne par l’eau de pluie, soit à la chute des feuilles sur le sol. Les vendanges n’exportent qu’une infime partie du cuivre apporté par les traitements fongiques (Maquenne et Demoussy, 1919; Flores-Velez, 1996). L'usage répété de ce fongicide a donc entraîné une accumulation de cuivre dans les couches superficielles de sol. Les teneurs naturelles des sols ont pu être multipliées par un facteur 10 à 100. Ainsi, des concentrations de 200 à 1000 mg kg-1 sont souvent observées (Delas, 1963; Flores-Velez, 1996), soit bien au-dessus des normes fixées pour l'épandage de boues de stations d'épuration : en France 100 mg kg-1 (NF U 44-041, Afnor, 1999). Les sols européens sont parmi les sols agricoles les plus pollués en cuivre en raison de l'âge des vignobles. Les symptômes de phytotoxicité sur vigne dus à la présence de cuivre dans les sols ont été notés uniquement en sols acides. C'est essentiellement pour cette raison qu'il existe aujourd'hui peu de références bibliographiques sur les dangers liés à l'accumulation du cuivre dans les sols calcaires, malgré le fait que ces sols représentent 70 % des sols de vigne en France. De plus, la résistance de la vigne en place résulte du fait que son système radiculaire est établi en grande majorité audessous de la zone la plus enrichie en cuivre. Les troubles liés à la toxicité du cuivre se manifestent alors en général après arrachage d'une vieille vigne, sur la culture suivante mise en place dans la couche superficielle très riche en cuivre : plante annuelle ou plantier de jeunes plants de vigne (Brun, 1998). Dans le sud de la France et en particulier dans le Languedoc-Roussillon, la vigne a été au cours de ce siècle la principale culture de la région. Et, bien que le climat méditerranéen ne soit pas extrêmement favorable au développement du mildiou, la bouillie bordelaise a été largement utilisée dans le vignoble. Or, dans un contexte de déprise agricole et d'arrachage des vignes, près d'un tiers de la superficie totale du vignoble (soit 150 000 ha sur les 450 000 ha de vignes) a été arraché et remplacé par de nouvelles cultures entre 1975 et 1995. Se pose alors la question du devenir du cuivre accumulé dans ces sols majoritairement calcaires et en particulier des risques de contamination des chaînes trophiques d'écosystèmes terrestres. L’évaluation des risques écotoxicologiques que représente le cuivre dans ces sols impose d’estimer en premier lieu sa spéciation chimique dans les sols et sa biodisponibilité pour les plantes cultivées. Dans ce contexte, l'objectif général de l'étude est de préciser le déterminisme de la biodisponibilité du cuivre pour des plantes cultivées. Autrement dit, il s'agira d'identifier certains des processus de mobilisation du cuivre mis en œuvre dans la rhizosphère par différentes espèces végétales cultivées sur des sols de vigne contaminés par le cuivre et présentant des propriétés physico-chimiques contrastées.

8

Chapitre I : Analyse bibliographique I – 1. LE CUIVRE DANS LE SOL I – 1 1. Localisation et spéciation du cuivre dans le sol Distribution du cuivre dans le profil de sol

Des recherches antérieures sur le mouvement des métaux dans le sol ont montré que la plupart des métaux apportés aux sols calcaires ont tendance à rester à la surface (Mc Laren et Crawford, 1973; Kuo et al., 1983; Miller et al., 1983; Planquart et al., 1999). Ce faible déplacement des éléments est attribué au pH des sols, ainsi qu'à l'adsorption des éléments métalliques sur les différents constituants des sols, en particulier la matière organique dans le cas du cuivre, qu'elle soit endogène ou exogène apportée par exemple par épandage de boues de stations d'épuration. Dans le cas de sols ayant reçu des apports importants de métaux sans incorporation simultanée de matière organique, comme dans le cas de la bouillie bordelaise, les études de mobilité sont presque inexistantes. Mullin et al. (1982) ont montré que la mobilité de Cu et de Zn après applications sous forme de sulfates pendant quinze ans, est négligeable pour des sols à pH 6-7, ayant des teneurs faibles en matière organique. Brun (1998) rapporte aussi que le Cu apporté par les traitements phytosanitaires se retrouve essentiellement dans l’horizon supérieur (0-20 cm) des sol viticoles calcaires du Languedoc (Figure I,1a), mais aussi de sols viticoles acides sableux du Beaujolais (Figure I,1b) ou de sols viticoles de sept régions italiennes (Figure I,1c). Concentration en Cu total (mg kg-1 sol)

Profondeur (cm)

0

0

100 200 300

100 200 300

0

0

0

0

20

20

20

40

40

40

60

60

60

80 100

a

80 100

b

80 100

100 200 300

c

Figure I,1. Distribution de Cu dans les profils de différents sols viticoles à la suite de l'utilisation de fongicides cupriques : (a) sols calcaires du Languedoc, (b) sols acides sableux du Beaujolais, (c) sols italiens (d'après Brun, 1998).

Aucune migration importante en profondeur par lixiviation n'a pu être mise en évidence expérimentalement quel que soit le type de sol (Delas, 1963). Néanmoins, le défoncement des sols de vigne peut contribuer à la redistribution des métaux d'origine anthropique dans le sol, par un enfouissement de l'horizon superficiel le plus contaminé (Flores-Velez, 1996; Brun, 1998). Spéciation et mobilité chimique du cuivre dans le sol

Dans le sol, les variations des conditions physico-chimiques du milieu (pH, Eh, CEC, concentrations ioniques) gouvernent les multiples réactions d’adsorption/désorption, de précipitation/dissolution et d'oxydation/réduction qui contrôlent le devenir de Cu, c’est à dire les concentrations en Cu ionique et complexé dans la solution du sol et par conséquent la 9

mobilité de Cu (Sims et Patrick, 1978; Lindsay, 1979; Lexmond, 1980; Kuo et al., 1983; Shuman, 1986; Flemming et Trevors, 1989; Mc Bride, 1989). La mobilité chimique de Cu dans les sols peut être définie comme l’aptitude de Cu à être transféré vers des compartiments du sol où il est moins énergiquement retenu; le compartiment ultime est représenté par la solution du sol dans laquelle Cu est immédiatement assimilable par les plantes (Loué, 1993; Juste et al., 1995). Le cuivre apporté au sol peut être redistribué entre deux compartiments du sol, la phase liquide et la phase solide. Les teneurs en Cu de la solution du sol sont généralement très faibles. D’après Mench (1990), dans les sols non contaminés, la solution du sol de sols sableux acides dont le pH est compris entre 2,5 et 4 contient, en moyenne 11µM de Cu, et celle de sols calcaires dont le pH varie de 7,5 à 7,8 contient, en moyenne 0,8µM de Cu (Tableau I,1). Pour des sols ayant 20 à 30 % d’humidité relative, ces résultats signifient que Cu en solution, dont 98 % sont complexés à la matière organique, représente toujours moins de 1 % de Cu total (et 10 fois moins encore en sol calcaire) (Loué, 1993). Il est important de souligner dans le tableau I,1 que la solution du sol présente une concentration en Cu minimale pour le sol ayant un pH intermédiaire (pH 5,5 à 6,5). Tableau I,1. Concentration en Cu dans la solution du sol (obtenue après centrifugation) de différents types de sols non contaminés (d'après Mench, 1990).

Sols pH Cu (mg L-1) Cu (µM)

sableux acide 2,5 - 4 0,762 11

sableux sablo-limoneux limoneux 4 – 4,5 5,5 – 6,5 7 – 7,5 0,076 0,019 0,051 1,2 0,3 0,8

calcaire 7,5 – 7,8 0,051 0,8

100

Concentration en Zn dans la solution du sol (µg L-1)

Concentration en Cu dans la solution du sol (µg L-1)

Dans un sol naturellement contaminé par Cu, des mesures équivalentes ont été rapportées par Tyler et Olsson (2001) pour la solution du sol d'un sol acide chaulé par CaCO3 et contenant 142 mg kg-1 de Cu (Figure I,2). En effet, la concentration en Cu de la solution du sol ne s'élève qu'à 0,07 mg L-1 (1,1 µM) à pH 5,3 s'abaisse jusqu'à 0,04 mg L-1 (0,6 µM) à pH 6,5, atteint 0,09 mg L-1 (1,4 µM et 0,01 % de Cu total) à pH 7,5 puis diminue au delà. Il semblerait donc que la concentration en Cu présente un minimum entre pH 6 et 6,5 ce qui est conforme aux résultats de Mench (1990). Comparativement à d'autres métaux comme Zn par exemple (Figure I,2), Cu montre cependant une absence de relation avec le pH (Tyler et Olsson, 2001).

80 60 40 20

100 80 60 40 20 0

0 5

6

7

pH de la solution du sol

8

5

6

7

8

pH de la solution du sol

Figure I,2. Concentration en Cu et en Zn dans la solution du sol d'un sol acide contaminé en Cu (142 mg kg-1) et contenant 63 mg kg-1 de Zn, en fonction du pH obtenu par chaulage avec CaCO3 (d'après Tyler et Olsson, 2001).

10

Ces deux exemples soulignent parfaitement que la détermination de la teneur totale des métaux dans le sol n'est en aucun cas le reflet de la redistribution des métaux dans le sol et la solution du sol et surtout que l'essentiel de Cu est lié à la fraction solide du sol (Gupta et Chen, 1975; Davies, 1992; Juste et al., 1995; Qian et al., 1996). Puisque les formes géochimiques que présentent des métaux comme Cu dans le sol ont des propriétés physiques et chimiques variées, la détermination de la teneur totale des métaux dans le sol ne fournit qu’une information partielle sur les interactions possibles avec les différents constituants du sol. De fait, il semble intéressant de déterminer la spéciation de Cu en phase solide (spéciation lato sensu). La spéciation de Cu est définie ici comme la répartition et la quantification des différentes formes chimiques de cet élément dans le sol, i.e. des phases porteuses responsables de sa rétention (Tessier et al., 1979). L'adsorption des métaux sur la fraction solide du sol est un premier processus qui contrôle les concentrations des métaux présents dans la solution du sol. Les minéraux argileux, les oxydes (terme générique employé ici pour les oxydes, hydroxydes et oxyhydroxydes) et les matières organiques sont les principaux constituants du sol qui contribuent à l'adsorption des éléments traces (Kabata-Pendias et Pendias, 1992; Alloway, 1995). Le cuivre peut être adsorbé à la surface des oxydes de fer, de manganèse (Mc Laren et Crawford, 1973; Mc Kenzie, 1980) et à la surface des minéraux argileux (Mc Laren et Crawford, 1973; Traina et Doner, 1985). Il peut être par ailleurs très fortement adsorbé mais aussi complexé par les matières organiques, elles même souvent adsorbées sur les minéraux argileux et les oxydes, comme c'est le cas des substances humiques et fulviques du fait de leur richesse en groupements fonctionnels carboxyles, phénols et hydroxyles (Mc Carthy et O'Cinneide, 1974; Murray et Linder, 1984; Shuman, 1988). Selon Besnard (1999), Cu est aussi fortement fixé sur les matières organiques peu évoluées telles que les débris végétaux grossiers (résidus de cultures, sarments sous vigne). En quantité moindre, Cu peut être présent dans les réseaux des minéraux secondaires comme des carbonates, des sulfures, des oxydes de fer et de manganèse, et enfin dans les minéraux primaires, dans le cas de Cu appartenant au fond géochimique (Lindsay, 1979; Alloway, 1995). Effets des propriétés physico-chimiques et des constituants du sol sur la spéciation du cuivre dans le sol

Les deux principaux mécanismes impliqués dans l'adsorption des métaux, classés selon la nature des interactions mises en jeu, sont la chimisorption (adsorption spécifique) et la physisorption (adsorption non spécifique) (Mc Bride, 1989; Kabata-Pendias et Pendias, 1992; Alloway, 1995) : - L'adsorption spécifique met en jeu des forces de liaisons fortes (liaisons covalentes ou liaisons de coordinations) entre les ions et constituants du sol. La liaison covalente est assurée par un doublet d'électrons commun à deux atomes, chaque atome fournissant un électron. La liaison est dite de coordination si l'un des deux atomes (donneur) fournit un doublet d'électrons à l'autre (accepteur). L'adsorption spécifique des métaux dépend principalement du pH du sol et de l'état d'hydrolyse du métal. La valeur de pK (où K est la constante de dissociation) de la réaction M2+ + H2O ↔ MOH+ + H+ détermine l'adsorption ou non du métal sur une surface minérale ou sur une substance organique (Kabata-Pendias et Pendias, 1992). Généralement, l'adsorption spécifique augmente quand le pK décroît : Cd (pK = 10,1) < Ni (pK = 9,9) < Co (pK = 9,7) < Zn (pK = 9,0) >> _

partie aérienne

racine

? Teneur en Cu total dans sol

Teneur en Cu dans plante

H+ / HCO3-, OH-

pH

Figure 1. Schéma récapitulatif des principales conclusions

Teneur en Cu dans racine

PS

(mobilité Fe réduite)

sol carbonaté

(fort pouvoir tampon)

autres mécanismes de prélèvement de Cu ? (autres ligands organiques, transporteurs métalliques)

complexation ?

?

Cu échangeable

Spéciation de Cu :

pH

Teneur en Cu dans racine et/ou apoplasme

sol carbonaté pH faible

sol acide

Rhizosphère

phytosidérophores (PS) ligands organiques ??

exsudation

excrétion

Translocation de Cu restreinte

Spéciation de Cu phase solide (extractabilité) : extractions chimiques spécificité non satisfaisante en parallèle

Teneur en Cu total dans sol

Teneur en Cu dans plante

acides

Teneur en Cu dans racines

+

_

Teneur en Cu dans parties aériennes

Sols

Cu2+

Cu2+

carbonatés

+

Cu2+ Cu2+

Cu2+

Cu2+-OOC-R Cu2+ Cu2+ OOC-R

Membrane plasmique Symplasme Apoplasme

Phytotoxicité

Plante

>>

Biodisponibilité du cuivre pour la plante et spéciation du cuivre dans le sol (en phase solide) Dans ce travail, la biodisponibilité de Cu a été définie comme la portion de Cu dans le sol qui est disponible pour être prélevée par la plante (Thornton, 1999). En d’autres termes, pour un système sol-plante, la biodisponibilité de Cu est l'aptitude de Cu à être transféré d'un compartiment du sol vers le système racinaire de la plante (Juste et al., 1995). La biodisponibilité a été évaluée et prédite au travers de deux approches : (i) en analysant les teneurs en Cu et/ou quantités de Cu bio-accumulées dans les racines et parties aériennes de la plante et (ii) en mesurant l'extractabilité de Cu par différentes extractions chimiques. La pertinence d'un extractant pour évaluer la biodisponibilité de Cu a ainsi pu être validée par confrontation aux données issues de l’analyse du végétal. Biodisponibilité de Cu estimée par l'analyse des teneurs en Cu dans les plantes

Les teneurs en Cu mesurées dans les parties aériennes des plantes cultivées sur les sols viticoles acides et calcaires plus ou moins contaminés en Cu provenant du bassin versant de Roujan n'ont jamais atteint les seuils critiques de phytotoxicité définis dans la littérature et dont les valeurs varient selon les espèces végétales (figure 1). D'ailleurs, aucun symptôme de toxicité caractéristique tel que la diminution de la production de biomasse racinaire, des parties aériennes, l'apparition de nécroses ou d'une chlorose ferrique n'a été observé lors des cultures, même pour les plantes ayant poussées sur les sols acides ou les sols les plus contaminés (sols calcaires). Ce résultat n'est pas complètement surprenant puisque (i) les sols acides échantillonnés dans le bassin versant de Roujan se sont en fait avérés être modérément contaminés en cuivre (teneurs inférieures à 200 mg kg-1), insuffisamment en l’occurrence pour induire une toxicité cuprique pendant les quelques jours d’exposition des plantes testées et (ii) Cu est réputé peu mobile et biodisponible en sols calcaires. Cependant, il est possible que notre dispositif ait conduit à une sous-estimation de la phytotoxicité du cuivre, à plusieurs titres : en premier lieu, parce que les racines ne croissent pas directement dans le sol et sont donc, de ce fait moins directement exposées. Ensuite, parce qu’une diminution de l’élongation racinaire, reconnue comme un des premiers effets d’une phytotoxicité de Cu, a peu de chance d’être manifeste dans ce type de dispositif : il est propice à une absence de répercussions sur l’acquisition de l’eau et des nutriments (le volume de sol prospecté est ici défini par la géométrie du dispositif, non par l’architecture racinaire; en outre l’eau et les nutriments sont fournis en quantités non limitantes par la solution nutritive) ; seule la biomasse racinaire est mesurée, alors qu’il est connu que c’est la longueur de racine qui est affectée davantage que la biomasse. En second lieu, la courte durée de contact avec le sol combinée avec l’utilisation de plantes âgées de 3 semaines et présentant une biomasse assez élevée conduit à une relative dilution des quantités de Cu prélevées par la plante. Il serait intéressant à titre de perspective de poursuivre ce type d’expérience sur des temps d’exposition plus longs pour vérifier si la phytotoxicité peut se manifester au-delà du court terme. Par ailleurs, il semble que l'analyse des teneurs en Cu dans les parties aériennes ne soit pas toujours un bon indicateur de la phytotoxicité de Cu. En effet, comme l’avaient montré quelques travaux antérieurs (Mitchell et al., 1978 ; Lexmond et van der Vorm, 1981 ; Brun et al., 2001), les teneurs en Cu dans les racines peuvent atteindre des valeurs dix fois supérieures à celles mesurées dans les parties aériennes (Figure 1). Les plantes sont ainsi capables de restreindre la translocation de Cu des racines vers les parties aériennes (Figure 1) afin de ne pas atteindre le seuil critique de toxicité de la plante; ce phénomène qui recouvrent plusieurs processus physiologiques participe sans doute largement à l’homéostasie d’éléments traces métalliques qui est connue pour être particulièrement efficace pour Cu (Clemens, 2001). Mon 159

travail de thèse a révélé à ce titre des différences assez notables entre les espèces testées, en terme de répartition du cuivre dans la plante (partitionnement racines/parties aériennes). Les plus fortes translocations vers les parties aériennes ont été observées pour le colza; ceci semble être un trait commun aux Brassicacées qui ouvre des perspectives à leur utilisation dans le cadre de la phytoremédiation de sols contaminés par des métaux (Ebbs et al., 1997) Globalement, il est apparu que les teneurs en cuivre mesurées dans les parties aériennes étaient indépendantes du niveau de contamination en Cu du sol (des teneurs en Cu dans le sol, qu’elles soient les teneurs totales ou les teneurs mesurées avec divers extractants chimiques plus ou moins doux). Par conséquent, les teneurs en Cu dans les parties aériennes ne sont pas de bons indicateurs de la contamination en Cu du sol, ni de la biodisponibilité. En revanche, quels que soient les sols, les plus fortes teneurs en Cu ont été mesurées dans les racines. Il s’est avéré en outre, sur une population de 24 échantillons de sols calcaires, que les teneurs en Cu des racines augmentent linéairement avec les teneurs en Cu dans le sol, qu’il s’agisse encore une fois des teneurs en Cu totales ou des teneurs mesurées avec divers extractants chimiques plus ou moins doux (Figure 1). Etant donné le faible nombre de sols acides retenus pour cette étude (5 échantillons seulement), il n'a malheureusement pas été possible d'établir, de façon statistiquement acceptable, de telles relations (entre la teneur en Cu dans les plantes et la teneur en Cu dans le sol) (Figure 1). Cependant, les teneurs en Cu racinaires dans les sols les plus acides se sont toujours avérées supérieures aux teneurs en Cu des racines des plantes ayant poussé sur sol calcaire présentant des niveaux de contamination comparable. Ces résultats sont en accord avec d'autres travaux décrits dans la littérature (Mitchell et al., 1978; Lexmond and van der Vorm, 1981, Brun et al., 2001). Les teneurs en cuivre dans les racines apparaissent donc comme le meilleur indicateur pour évaluer les risques de contamination des plantes et la biodisponibilité de Cu dans les sols, au moins dans le cas des sols calcaires. Toutefois, s’il est admis que Cu se fixe particulièrement dans l'espace pariétal, les sites et modalités (processus physico-chimique ou physiologique) d'accumulation de Cu dans les racines doivent encore être précisés. De fait, les mesures de teneur en Cu apoplasmique ont été réalisées sur les racines récoltées. A ce titre, encore une fois, il faut souligner que le dispositif expérimental utilisé s’est avéré être un outil précieux pour les collecter aisément sans les endommager. Les résultats ont montré que la majorité de Cu (25 – 85 % de la teneur en Cu totale dans les racines) est fixé au niveau du complexe pariétal, sans doute adsorbé sous forme cationique par les charges négatives des constituants des parois cellulaires (groupement carboxyliques –COOH) (Figure 1). Par conséquent une très faible quantité de Cu est effectivement absorbée (transférée à l'intérieur des cellules) et donc réellement toxique pour la plante (Figure 1). La littérature ne fournit malheureusement aucune donnée concernant les teneurs en Cu admissibles dans les racines. Les difficultés rencontrées pour récolter et laver minutieusement les racines après une culture en pot ou au champ en sont sans doute les principales raisons. Une perspective intéressante dans le futur consisterait à établir des références en la matière, afin de permettre de porter un diagnostic sur les risques associés à des niveaux de contamination plus ou moins élevés des racines par Cu. La biodisponibilité de Cu dans le sol n’a pas seulement été estimée au travers des teneurs en Cu des racines (ou des parties aériennes). Elle a également été calculée en se fondant sur les prélèvements effectifs de Cu par les plantes, exprimés par unité de masse de sol sec fourni lors de la culture (soit environ 2,5g par pot). Cette valeur est équivalente à la quantité de Cu bio-accumulée (biomasse en g de MS par pot x teneur en Cu dans la plante en µg par g de MS, dans un pot) diminuée de la quantité de Cu bio-accumulée pendant les 3 semaines de culture en hydroponie (préalablement à la mise en contact avec le sol). La comparaison de la biodisponibilité pour deux espèces n'a cependant pas toujours été aisée, car les différences de biomasses entre chacune d'elles étaient parfois importantes, malgré les précautions prises (ajustement du nombre de graines par pot, par exemple). Cette approche a permis de comparer 160

la quantité de Cu prélevée par la plante à la teneur en Cu total dans le sol. Suivant les espèces végétales, les sols et les traitements imposés, les quantités de Cu biodisponible, i.e. prélevées par les plantes, ont varié entre 2 et 20% de la teneur totale en Cu dans le sol, ce qui est notable compte tenu de la faible durée de contact. Ceci pourrait s’expliquer par la faible quantité de sol mis à disposition. Cependant, les tests conduits en faisant varier l’épaisseur de sol (Chapitre II) ont révélé que la majeur partie du cuivre effectivement biodisponible (prélevé par la plante) provenait essentiellement du premier millimètre de sol. Par conséquent, les résultats obtenus sont valides en ce sens qu’il peut être conclu que les plantes ont prélevé entre 2 et 20% du cuivre total dans la rhizosphère. Les données 'plantes' des deux articles du chapitre IV, notamment les valeurs de Cu biodisponible estimées par les teneurs en Cu dans les parties aériennes et les racines et les biomasses de colza ayant poussé sur un même sol acide ne se sont pas avérés aussi reproductibles que ce que nous attendions. En effet, les quantités de Cu prélevées par le colza correspondent à 13,6 et 3,1% du Cu total du sol utilisé, suivant l’expérience. Outre la durée de contact sol – plante différente (en raison d’une mauvaise interprétation du protocole par un étudiant : 8 jours pour la première expérience et 7 jours pour la seconde expérience), il est possible que le protocole expérimental ait été modifié par inadvertance (modification des conditions climatiques de la chambre de culture, de la composition de la solution nutritive, du pas de temps de renouvellement de la solution nutritive) puisque ces deux cultures ont été conduites à un an d'intervalle par deux expérimentateurs différents. En outre, la présence d'algue (avérée dans la première expérience) et/ou d’autres micro-organismes aurait pu aussi modifier les conditions de la culture-test. En effet, ces expériences n'ont pas été réalisées en conditions axéniques, de sorte qu'il n'est pas impossible d'écarter complètement la contribution de micro-organismes à la mobilisation de Cu et aux processus sous-jacents. Biodisponibilité de Cu estimée par l'extractabilité de Cu dans les sols

La teneur totale en cuivre dans le sol n'apportant a priori que peu d'information sur la biodisponibilité de Cu, son extractabilité, c'est à dire sa faculté à passer en solution sous l'effet d'extractants chimiques plus ou moins doux a été mesurée dans les sols non cultivée et les sols rhizosphériques. Il faut noter encore une fois qu’à notre grande surprise, la teneur en Cu total s’est avérée a posteriori un indicateur aussi bon que des extractants plus doux tels que Na2EDTA, tout au moins au sein de la population de sols calcaires étudiés. Il est peu probable cependant que tel soit encore le cas sur une population plus large de types de sols, comme l’ont montré les quelques sols acides inclus dans cette étude (Chapitre III). De nombreuses méthodes d'extractions chimiques ont été testées pour simuler les phénomènes qui contrôlent la biodisponibilité de Cu et donc extraire Cu de la fraction de Cu du sol qui peut être biodisponible. Outre Na2-EDTA qui, au même titre que DTPA est généralement utilisé pour estimer Cu biodisponible, plusieurs extractants ont été utilisés en parallèle pour extraire le Cu de la fraction échangeable (CaCl2), le Cu de la fraction acido-soluble telle que les carbonates (Na-acétate/acide acétique), le Cu de la fraction réductible, telle que les oxydes de Fe ou de Mn (hydrochlorure d'hydroxylamine) enfin, le Cu de la fraction oxydable telle que les matières organiques (K-pyrophosphate). Ces extractions chimiques ont permis de montrer que la spéciation (distribution sur les différentes phases solides porteuses) de Cu dans les sols acides est différente de celle des sols calcaires. Dans les sols acides, Cu semble en partie lié aux phases échangeables, oxydables ainsi qu'à la phase réductible. En revanche, dans les sols calcaires, Cu semble lié principalement à la phase oxydable et, dans une moindre mesure, aux phases réductibles et acido-solubles (Cu échangeable négligeable). Toutefois, il est important de souligner qu'aucune de ces méthodes d'extraction chimique n'est pleinement satisfaisante : elles ne permettent pas en effet de déterminer sans ambiguïté les associations de Cu avec les 161

différents types de constituants du sol définis ci-dessus. En effet, ces extractants sont susceptibles d'agir sur plusieurs fractions du sol et par conséquent le Cu d'une phase non visée peut être extrait (Figure 1). C'est pourquoi, la somme des quantités de Cu extraites par les 4 extractants chimiques 'spécifiques d'une fraction de sol' est apparue dans de nombreux cas largement supérieure à la teneur totale en Cu dans le sol. Néanmoins, pour juger de la validité d'une méthode d'extraction pour prédire le Cu biodisponible, des corrélations entre les teneurs en Cu obtenus par ces extractions chimiques du sol et les teneurs en Cu dans les parties aériennes et les racines des végétaux ont été établies. Aucune corrélation linéaire significative n'a pu être établie avec les teneurs en Cu dans les parties aériennes. Cependant, dans le cas des sols calcaires uniquement, de fortes corrélations linéaires, positives ont été trouvées entre les teneurs en Cu dans les racines et la teneur totale en Cu dans le sol, mais aussi avec la teneur en Cu extractible par K-pyrophosphate et par Na2-EDTA; ces résultats confirment l'importance de mesurer la teneur en Cu dans les racines et la pertinence de ces extractions chimiques pour prédire la biodisponibilité de Cu pour la plante, tout au moins au sein d’une population de sols apparentés. Le but de ces extractions chimiques était aussi de déterminer la réponse du sol aux changements de conditions chimiques (pH, potentiel rédox, concentration en exsudats complexants) induits par les plantes. Dans un sol acide préalablement chaulé, l'effet du pH a été ainsi observé sur les quantités de Cu extraites par CaCl2 (fraction échangeable) (Figure 1). Cependant les variations (augmentation ou diminution) de Cu extrait par chaque extractant chimique dans le sol avant culture et le sol rhizosphérique ne correspondaient à aucun moment à la quantité de Cu prélevée par la plante, c'est à dire au Cu biodisponible du sol. Ces résultats confirment l'hypothèse selon laquelle la plante ne prélève pas Cu dans une fraction du sol donnée mais certainement dans plusieurs fractions. L'implication du pH du sol dans le déterminisme de la biodisponibilité de Cu doit être confirmée sur une plus large gamme de sol acides et neutres : en effet le faible nombre de sols non calcaires étudié (ceux-là étant faiblement représentés dans le bassin versant où l’échantillonnage a été réalisé) n’a pas permis de pousser plus en avant l’analyse statistique de cette population de sols. De plus, il aurait été intéressant d'aller plus loin dans la détermination de la spéciation de Cu dans les sols étudiés. Il faut reconnaître dans ce domaine un manque cruel de méthodes ad hoc, adaptés à la manipulation de grands nombres d’échantillons de sol, de petite taille qui plus est. Il eût été également intéressant d’identifier les différentes formes de Cu se trouvant dans le surnageant des extractions au CaCl2 afin d'estimer le rapport ion libre / ion complexé en solution et de le confronter aux mesures des teneurs en Cu des plantes, compte tenu des succès obtenus dans d’autres études de ce type (e.g. Sauvé et al., 2000).

Biodisponibilité du cuivre, propriétés physico-chimiques du sol et de la rhizosphère La biodisponibilité de Cu dépend de la spéciation de Cu qui est contrôlée par les propriétés physico-chimiques du sol. Or, les changements de paramètres physico-chimiques induits par les racines dans la rhizosphère peuvent influencer les processus impliqués dans la rétention de Cu par les minéraux et la matière organique et libérer ainsi le Cu. Le rôle majeur de la matière organique et des oxydes de Fe dans la rétention de Cu dans les sols calcaires étudiés ici, mais aussi dans sa biodisponibilité a été montré au chapitre III. Une fois encore, l'implication du pH dans le contrôle de la biodisponibilité de Cu n'a pu être mise en évidence pour les sols acides. Cependant, l'impact de deux processus mis en jeu par différentes espèces végétales pour mobiliser le Cu dans le sol au niveau de la rhizosphère a été évalués, dont l’un porte précisément sur les modifications de pH rhizosphérique. 162

Biodisponibilité de Cu et variations de pH induites par les racines dans la rhizosphère

L'approche expérimentale fournissant un accès aisé aux parties aériennes, aux racines et au sol rhizosphérique a permis d'estimer les effets des changements de pH induits par les racines sur la biodisponibilité de Cu. Les résultats obtenus sont plutôt inattendus puisque les racines de tomate et de colza ont induit des changements de pH d’intensité et de sens différents dans leur rhizosphère, selon les conditions initiales de pH : une acidification a été mesurée en sol calcaire alors qu'une alcalinisation a été détectée en sol acide (Figure 1). De plus, la biodisponibilité de Cu a augmenté avec le pH (alcalinisation) en sol acide (Figure 1). Le colza a alcalinisé davantage sa rhizosphère que la tomate, et a prélevé quantitativement plus de Cu que la tomate. Ces résultats ont montré aussi que l’acidification rhizosphérique en sol calcaire s’est produite indépendamment de la source d'azote (nitrate ou ammonium) et pose donc la question de l'origine de ce phénomène. En effet, ceci indique que l'équilibre des charges (bilan du prélèvement des anions/cations) n'est pas le seul responsable de ces variations de pH mesurées. Il est probable que la respiration joue un rôle dans l'acidification des sols calcaires. En outre, d'autres mécanismes tels l'excrétion de protons ou d'anions organiques comme stratégies mises en place pour prélever des éléments nutritifs peu mobiles en sols calcaires, tels que Fe ou P, peuvent aussi intervenir. Dans une seconde expérience, où le sol acide a été préalablement chaulé (pH 3,7-6,1), le colza a encore induit des changements de pH dans sa rhizosphère variant de sens et d’intensité avec le pH initial du sol (Figure 1). Le colza a alcalinisé sa rhizosphère en dessous de pH 4,8 et l'a acidifiée au delà de pH 4,8. Contrairement aux résultats précédents, les variations de pH n'ont pas induit de variations de biodisponibilité de Cu. Le colza a probablement atténué les effets de chaulage escomptés en modifiant le pH de la rhizosphère. Il faut noter toutefois que c’est dans cette expérience que les quantités de Cu prélevées par le colza se sont avérés nettement plus faibles que dans l’autre expérience analogue (ci-dessus). Brun (1998), Brun et al. (2001) avaient déjà souligné l’existence dans le vignoble languedocien de sols peu acides à calcaires, contaminés en Cu (120 à 250 mg kg-1) susceptibles d’affecter la croissance d’espèces cultivées en raison d’une forte biodisponibilité de Cu. Ils avaient aussi montré, contre toute attente, que la biodisponibilité de Cu ne diminuait pas quand le pH augmentait. Toutefois, il est apparu que le Cu apoplasmique des racines de colza a augmenté avec le pH de la rhizosphère (Figure 1). Ces résultats ont été interprétés comme une conséquence probable de l’augmentation de la dissociation et de l'affinité de Cu pour les composés des parois cellulaires avec le pH, c'est-à-dire l'augmentation de l'adsorption de Cu sur les groupements carboxyliques des parois cellulaires déprotonés à de telles valeurs de pH (et protonés à pH plus acide) (Figure 1). Ce processus va à l'encontre de l'idée générale selon laquelle la biodisponibilité de Cu diminue quand le pH augmente, en raison de la diminution attendue de la solubilité de Cu dans le sol. Néanmoins, les parois des cellules des racines présentent des caractéristiques physico-chimiques comparables avec la matière organique du sol, telles que les charges variables, i.e. pH-dépendantes, associées à leur nombreux groupements carboxyliques. Par conséquent, quand le pH augmente, les sites de fixation de Cu par les matières organiques du sol mais aussi des parois des cellules racinaires agissent dans le même sens et entrent en compétition pour adsorber Cu. Ceci pourrait expliquer l'augmentation de Cu adsorbé dans l'apoplasme lorsque le pH augmente, malgré une diminution effective de la solubilité de Cu (Chapitre IV). D’après ces résultats, l’efficacité du chaulage pour corriger la phytotoxicité de Cu est tout à fait critiquable. Il est probable que l’apport de matière organique exogène par épandages de 163

boues de stations d’épuration couplé au chaulage soit mieux adapté pour réduire la mobilité des éléments traces dont le Cu, (i.e. la biodisponibilité de Cu), comme l’avait déjà observé Delas (1983 ; 1984). Biodisponibilité de Cu et exsudation de phytosidérophores induite par les racines dans la rhizosphère

Le parallélisme entre l'exsudation de phytosidérophores induits par les racines de deux génotypes de blé tendre et la biodisponibilité de Cu ont été clairement mis en évidence et constituent un des résultats les plus originaux de ma thèse. En sol calcaire, la mobilité chimique et la biodisponibilité des éléments traces sont souvent réduites (Figure 1). L'acidification de la rhizosphère est une stratégie mise en place par les plantes pour prélever les éléments nutritifs peu mobile. Cependant, aucune variation de pH n'a été détectée dans la rhizosphère du blé en raison de l'effet tampon du sol. Par conséquent, les variations de pH induites par les racines de blé ne jouent pas de rôle significatif dans l'acquisition de Cu du sol. Cette stratégie d’acidification de la rhizosphère pour acquérir Fe (ou P) lorsqu’ils sont limitants, notamment en milieu calcaire, est cependant l’apanage d’autres espèces que les graminées. Chez ces dernières, il est reconnu l’existence d’une autre stratégie qui consiste à exsuder des complexants de Fe, les phytosidérophores (Marschner et Römheld, 1994) (Figure 1). De fait, la forte libération des phytosidérophores en réponse à une carence en Fe (mais pas en Zn) chez les racines de blé a été mise en relation avec une augmentation très significative (facteur 2 à 4) des quantités de Cu effectivement prélevées par les plantes, i.e. de Cu biodisponible (Figure 1). Il semblerait donc qu’outre l'acquisition d'éléments nutritifs, les phytosidérophores pourraient aussi contribuer à la contamination de la plante. Ces résultats ne seraient pas surprenants dans la mesure où les phytosidérophores forment des complexes particulièrement stables avec Cu (plus encore qu’avec le fer ferrique). L’importance de ce processus doit être particulière en sols calcaires où la faible disponibilité de Fe et Zn favorisent l’exsudation de phytosidérophores par les racines de graminée. Toutefois, il convient de rester prudent quant à conclure à une relation de cause à effet entre la libération de phytosidérophores et le prélèvement de Cu par le blé (Figure 1). En effet, la carence en Fe stimule également la synthèse de transporteurs métalliques au niveau des membranes plasmiques des cellules racinaires. Or, ces transporteurs, non spécifiques d'un métal donné, pourraient également participer au prélèvement de Cu par le blé (Figure 1). Dans le sol calcaire étudié, la durée de la culture n'a pas permis d'atteindre un niveau de phytotoxicité avéré. Ces résultats sont néanmoins en accord avec les observations de Coullery (1996) qui a montré in situ sur d’anciens sols viticoles calcaires la forte capacité des graminées fourragères et des céréales à prélever des éléments traces dont Cu. Ces espèces présentaient par ailleurs les plus fortes contaminations en Cu. Toutefois, la multiplicité des mécanismes potentiellement impliqués au niveau de la rhizosphère fait qu'il est à la fois important et difficile de connaître la quantité, l'origine de Cu prélevé par les plantes, ainsi que les mécanismes par lesquels les plantes le prélèvent. Des recherches complémentaires sont nécessaires pour préciser les processus impliqués dans l'acquisition de Cu à l'interface sol-racine, mais aussi à l'interface apoplasme-symplasme au sein même de la racine. En effet, à l’instar de ce qui a été montré concernant la toxicité aluminique en sols acides (Calba et al., 1999), les phénomènes majeurs de détoxification se produisent à ce niveau, plus probablement que dans la rhizosphère. Certains de mes résultats, tant concernant le pH que l’exsudation de phytosidérophores, suggèrent que ces processus jouent un rôle particulier dans la mobilisation/l’immobilisation de Cu au niveau apoplasmique. Il s’agit de pistes de recherches à poursuivre dans le futur. 164

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173

Annexe Distribution de Cu dans la rhizosphère mesurée par spectroscopie de microfluorescence X – Mise au point méthodologique Valérie Chaignon1, Philippe Hinsinger1, Gérard Souche1, Camille Dumat2 et Guillaume Morin3 1

INRA, UMR Sol & Environnement, Place Viala, 34060 Montpellier Cedex 02. Laboratoire de Biochimie Isotopique, UMR 7618, UPMC 4 place Jussieu, 75252 Paris. 3 Laboratoire de Minéralogie et Cristallographie, UMR 7590, UPMC 4 place Jussieu, 75252 Paris. 2

Principe de la spectroscopie microfluorescence X

La fluorescence X, méthode d'analyse non destructive exploite la fluorescence des éléments dans le domaine des rayons X, pour obtenir des renseignements qualitatifs et quantitatifs sur la composition d'un échantillon (Ildefonse et al., 1999). La fluorescence X correspond à un mode de désexcitation d'un atome ayant absorbé une particule (chargée ou non). Dans le cas de la microfluorescence X sur un rayonnement synchrotron, les particules absorbées sont les photons X dont l'énergie est préalablement sélectionnée en faisant passer le faisceau au travers d’un monochromateur. Le cortège électronique de l'atome cible est perturbé par l'absorption de photons de grande énergie et va se réarranger en émettant des électrons (Auger) et des photons X. Le premier mode conduit à l'émission d'un spectre d'électrons mono énergétiques caractéristique de l'élément étudié et le second à l'émission de raies de fluorescence situées dans le domaine des rayons X dont l'énergie est également caractéristique de l'élément ionisé. Montage expérimental

Les expériences de microfluorescence X se sont déroulées sur le poste expérimental DCI (énergie 5 à 30 keV), montage FLUO, ligne de lumière D15A (responsable Monsieur P. Chevallier) du Laboratoire pour l'Utilisation de Rayonnement Electromagnétique (LURE) à Orsay en collaboration avec Guillaume Morin (Laboratoire de Minéralogie et Cristallographie, CNRS-Université Paris 6) et Camille Dumat (Laboratoire de Biochimie Isotopique, Université Paris 6 et 7). Lors de l'acquisition des données, le faisceau monochromatique était de 13,6 keV et la détection s'est faite en mode fluorescence avec un détecteur solide, à température ambiante. Les qualités du rayonnement synchrotron et le montage utilisé (Juillot, 1998) donnent un bon rapport signal/bruit permettant la détection d'éléments traces de l'ordre de la ppm, mais ne permettent pas de détecter des éléments plus légers que le potassium (Z < 19). En effet, le montage n’étant pas réalisé sous vide, l'air absorbe la fluorescence X émise par les éléments légers car les photons X sont peu énergétiques. Le faisceau pénètre dans l'échantillon sur une épaisseur comprise entre 100 et 300 µm. L'échantillon utilisé pour l'analyse en microfluorescence X provient d'une culture (en rhizotron) de jeunes plantules de tomates sur une couche mince d’un sol acide contaminé en Cu (échantillonné dans le bassin versant de Roujan, parcelle b122-123, éch. n°1, cf. chap. II), séché à l'air libre et tamisé à 300 µm. La couche mince de sol (500 µm d'épaisseur) a été étalée sur une plaque de verre selon la technique décrite par Casarin (1999) et développée par 174

Souche et al. (2001). Les racines des plantes issues d'une phase de germination d’une semaine, en conditions hydroponiques (sans contrainte mécanique pour les racines) ont été ensuite disposées à la surface de cette couche de sol, les parties aériennes dépassant de la plaque de verre (Figure 1). L'ensemble a été protégé par une seconde plaque de verre jusqu'au moment de l'analyse. Le rhizotron a été maintenu vertical, et la couche mince de sol a été connectée via un papier filtre (Glass Microfibre Filters, Whatman) à une solution nutritive complète dépourvue de CuCl2 et de FeNa-EDTA (Figure 1). Les jeunes plantules de tomate ont poussé ainsi pendant deux jours. Au moment de l'analyse en microfluorescence X, pour des raisons techniques, la plaque de verre inférieure supportant le sol et la plante a dû être découpée pour ne former plus qu'un carré de 5cm x 5cm autour de la racine, tandis que la plaque de verre supérieure a été retirée (pour ne pas absorber le rayonnement X).

Plantule de tomate

parties aériennes

Plaques de verre (épaisseur : 2mm L : 20cm l : 12cm)

racines

Couche mince de sol (épaisseur 500µm)

Papier filtre Solution nutritive carencée en Cu et Fe

Figure 1. Schéma du dispositif utilisé pour la culture de tomate sur couche mince de sol. Traitements des données

L'interface informatique du poste expérimental de la ligne D15A du LURE nous a permis d'acquérir des données d'analyses ponctuelles ainsi que des cartes de répartition élémentaires pour Cu, Fe, Mn, K, Ca, Zn et As. Pour les analyses ponctuelles, le spectre total de fluorescence X est enregistré pour chaque point. L'analyse des spectres de fluorescence X a été conduite à l'aide du programme WAPI3. Ce programme permet d'attribuer et de quantifier le nombre de coups reçu par le détecteur dans chaque gamme énergétique de chaque élément 175

effectivement présent dans l'échantillon étudié. Les valeurs attribuées à chaque élément correspondent en fait à la surface de leur pic de fluorescence, corrigée du bruit de fond. Sept pics de fluorescence caractéristiques ont été enregistrés pour analyser Cu, Fe, Mn, K, Ca, Zn et As (Tableau 1). Tableau 1. Valeurs des énergies (en keV) et valeurs attribuées aux pics de fluorescence caractéristiques de chaque élément retenu : Cu, Fe, Mn, K, Ca, Zn et As.

Cu Fe Mn K Ca Zn As

Énergie keV 6,04 6,40 5,90 3,30 3,70 8,65 10,53

Pics de fluorescence 319-334 245-270 228-239 119-136 136-148 345-358 422-439

Une première carte de répartition (600 µm x 600 µm) a été acquise avec un temps de comptage de 150 secondes par point et un pas de 20 µm entre chaque analyse (Figure 2a). Une deuxième carte de répartition (912 µm x 2000 µm) a été acquise avec un temps de comptage de 150 secondes par point, un pas de 912 µm dans la largeur et 50 µm dans la longueur, entre chaque analyse. Cette carte correspond en fait à deux transects de 2000 µm de long, perpendiculaires à la racine, le premier au niveau de l'apex et le second à 912 µm de l'apex (Figure 2b). Enfin, une troisième carte de répartition (700 µm x 2000 µm) a été acquise à 1350 µm de l'apex, avec le même temps de comptage de 150 secondes, un pas de 350 µm dans la largeur et 50 µm dans la longueur entre chaque analyse. Cette carte correspond à trois transects de 2000 µm de long, placés perpendiculairement à la racine, éloignés les uns des autres de 350 µm (Figure 2c). Couche mince de sol

Racines de tomate 5 4 3 12

a Carte de répartition n°1 (600 µm x 600 µm)

b

c

Carte de répartition n°2 transects 1 et 2

Carte de répartition n°3 transects 3, 4 et 5

(912 µm x 2000 µm)

(700 µm x 2000 µm)

Figure 2. Localisation des cartes de répartition à l'interface racine-sol rhizosphérique acquises pendant les analyses en microfluorescence X.

Le logiciel ORIGIN® a été utilisé pour la représentation des cartes de répartition élémentaires. Les données brutes utilisées pour la représentation correspondent à des nombres de coups de fluorescence. 176

Résultats et discussion

L’évaluation de la distribution des éléments et notamment de Cu à l’interface sol-racine, c’est à dire dans la rhizosphère et l’identification de phases porteuses de Cu, comme les oxydes de Fe ou Mn ont été effectuées à partir de la carte de répartition n°1 représentée pour chaque élément dans la figure 3. La zone blanche de la partie inférieure des cartes correspond à une période de coupure du faisceau pendant laquelle aucune mesure n’a pu être effectuée. La racine (environ 130µm d'épaisseur), dont les contours n’ont pu être délimités précisément, se situe dans la partie supérieure des cartes. Une gamme de couleur allant du gris foncé au gris clair établie à partir des nombres de coup de fluorescence indique les différents niveaux de fluorescence de chaque élément : gris foncé pour les plus élevés et gris clair pour les plus faibles. Pour l’ensemble des éléments analysés, la zone racinaire/périracinaire est la zone où les concentrations les plus élevées sont observées. Dans cette zone et en dehors de cette zone, i.e. dans le sol, des variations importantes de concentrations sont constatées, particulièrement pour Mn, Zn, As et K, rendant l’interprétation des cartes difficile. C’est également le cas de Ca, Fe et Cu, à un degré moindre cependant. Pour ces derniers éléments, un gradient de concentration est perceptible de part et d’autre de la racine, suggérant l’origine rhizosphérique de la distribution observée. En outre, il faut noter que les cartes de distribution de Cu et Fe sont très similaires. Toutefois, il faut rester prudent dans nos interprétations car les dimensions de la carte ne permettent pas de mesurer une éventuelle variation des niveaux de fluorescence au delà de la rhizosphère. De plus, le sol utilisé pour cette expérimentation est pauvre en Ca et faiblement contaminé en Cu (173 mg kg-1). Aussi, même avec un temps d’acquisition de 150 secondes, les coups de fluorescence mesurés pour Cu et Ca lors de chaque analyse sont peu élevés et les éventuelles variations dues à l'hétérogénéité du sol, mesurées à l’interface sol-racine, sont alors faibles et ne peuvent pas être mises en évidence avec cette représentation graphique. Par conséquent, ces cartes ne sont pas assez précises pour conclure à un éventuel effet rhizosphérique pour Cu et Ca. Pour identifier les phases porteuses de Cu dans le sol, d’éventuelles relations entre Cu et les autres éléments ont été évaluées en calculant les coefficients de corrélations linéaires (Tableau 2) entre deux éléments à partir des données numériques (coups de fluorescence) des cartes de répartition de la figure 3. Tableau 2. Coefficients de corrélation linéaire (r2) entre chaque élément (n = 900), déterminés à partir des valeurs de coups de fluorescence mesurés pour la carte de répartition n°1. Corrélations significatives marquées en gras à p < 0,05.

Cu Fe Mn K Ca Zn As

Cu 1

Fe 0,62 1

Mn 0,30 0,66 1

K 0,42 0,74 0,36 1

Ca 0,49 0,79 0,43 0,87 1

Zn 0,69 0,76 0,44 0,56 0,60 1

As 0,54 0,70 0,26 0,50 0,54 0,58 1

Cu est significativement corrélé avec Fe et Zn. Nous avions déjà montré l’importance des oxydes de Fe dans la rétention de Cu dans le sol. Par conséquent, la relation obtenue entre Fe et Cu est en accord avec les résultats présentés dans le chapitre III. Tout comme Cu, Zn est fortement corrélé à Fe. Ces deux éléments semblent donc avoir une forte affinité pour la même phase porteuse (oxydes de Fe), ce qui expliquerait alors la corrélation entre Cu et Zn. Cependant, le temps d’analyse (150 s par analyse) interdisant toutes répétitions, ces corrélations ne sont pas représentatives de l’ensemble de l’échantillon et ne fournissent donc que des informations ponctuelles sur la spéciation des éléments mesurés, notamment Cu. 177

Figure 3. Cartes de répartition (600 µm x 600 µm) de Cu, Fe, Mn, K, Ca, Zn et As.

Pour compléter les résultats obtenus précédemment et conclure ou non à un effet rhizosphérique dans le cas de Cu, Fe et Ca notamment, de nouvelles cartes, en l’occurrence des transects perpendiculaires à l’axe racinaire, ont été réalisées et sont présentées figures 4, 5, 6, 7. Les figures 4, 5, 6 et 7 représentent les 5 transects des 7 éléments analysés, de l'apex (transect 1), puis en s'éloignant de l’apex (transects 2 à 5).

178

Les distributions de Mn, K, Zn et As sont très hétérogènes et confirment les résultats précédent. Malheureusement, les distributions de Cu, Fe et Ca à l’interface sol-racine sont aussi hétérogènes que celles des autres éléments. Par conséquent, quelque soit l’élément considéré, aucune influence racinaire nette n’a pu être observée (au niveau de l’apex ni aux niveaux plus matures de la racine). L’analyse en microfluorescence X telle que mise en œuvre ici est une méthode originale dans la mesure où elle ne requiert aucune étape préalable de préparation de l’échantillon ; ces étapes sont en effet longues, voire fastidieuses et, de surcroît, source de multiples artefacts potentiels (redistribution d’élements par exemple, cf. chap. I, § 21). Mais elle est certainement mal adaptée pour évaluer quantitativement les phases porteuses de Cu dans le sol (la spéciation de Cu) qui reste un milieu complexe et très hétérogène, au moins dans le cas présent d’une pollution diffuse par Cu. En ce qui concerne l’observation des effets rhizosphériques, la méthode d’analyse ne doit pas être la seule incriminée dans les difficultés de tirer des conclusions claires. En effet, le protocole de culture peut être certainement amélioré lui aussi, en augmentant le temps de culture par exemple afin de travailler sur des racines plus grandes et donc plus facilement repérables sur les écrans de contrôle pendant l'analyse, ou en stimulant les changements chimiques de la rhizosphère en modifiant préalablement (avant la mise en contact avec le sol) la nutrition des plantes (cf. chapitres IV et V). Malheureusement, le temps nécessaire à la réalisation de telles expériences et les difficultés d’accès à l’instrument m’ont conduit à ne pas poursuivre plus en avant sur cette voie. C’est la raison pour laquelle ce travail est resté à ce stade d’essai méthodologique préliminaire qui justifie sa situation en annexe du manuscrit de thèse.

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179

racine rhizosphère

Cu

Coup de fluorescence

400

transect 5

350 300 250 200 150 100 50 0

0

500

1000

1500

2000

Distance, µm racine rhizosphère

Coup de fluorescence

400

transect 4

350 300 250 200 150 100 50 0

500

1000

1500

2000

Distance, µm racine rhizosphère

Coup de fluorescence

400 350

transect 3

300 250 200 150 100 50 0

500

1000

1500

2000

Distance, µm racine rhizosphère

Coup de fluorescence

400

transect 2

350 300 250 200 150 100 50 0

500

1000

1500

2000

Distance, µm racine rhizosphère

Coup de fluorescence

400 350

transect 1

300 250 200 150 100 50 0

500

1000

1500

2000

Distance, µm

Figure 4. Distribution de Cu le long de la racine, en s’éloignant de l’apex (transect 1 à 5) et dans la rhizosphère (0 à 2000µm). 180

Mn

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

racine

transect 5

0

500 1000 1500 Distance, µm

Coup de fluorescence

racine

2000

40 30 20 10 0

0

0

500 1000 1500 Distance, µm

2000

40 30 20 10 0

500 1000 1500 Distance, µm

Coup de fluorescence

2000

40 30 20 10 0

500 1000 1500 Distance, µm

Coup de fluorescence

2000

500 1000 1500 Distance, µm

2000

transect 2

40 30 20 10 0

0

500 1000 1500 Distance, µm

2000

racine

transect 1

0

0

50

racine

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

2000

racine

transect 2

0

500 1000 1500 Distance, µm

transect 3

50

racine

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

0

racine

transect 3

0

2000

transect 4

50

racine

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

500 1000 1500 Distance, µm

racine

transect 4

Coup de fluorescence

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

transect 5

50

racine

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

Fe

transect 1

50 40 30 20 10 0

0

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Figure 5. Distribution de Fe et Mn le long de la racine, en s’éloignant de l’apex (transect 1 à 5) et dans la rhizosphère (0 à 2000µm). 181

K

Ca racine

300 250 200 150 100 50 0

transect 5

0

500 1000 1500 Distance, µm

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

racine

2000

100 60 40 20 0

300 250 200

transect 4

150 100 50 500

1000

1500

2000

transect 4

60 40 20 0

0

150 100 50 500

1000

1500

2000

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

transect 3

1000

100

1500

2000

transect 3

80 60 40 20 0

0

500

1000

1500

2000

Distance, µm

racine

300 250 200

transect 2

150 100 50 500

1000

1500

2000

Coup de fluorescence

racine

Coup de fluorescence

500

Distance, µm

Distance, µm

100

transect 2

80 60 40 20 0

0

Distance, µm

500

1000

1500

2000

Distance, µm

racine

300 250 200

transect 1

150 100 50 500

1000

1500

Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

racine

Coup de fluorescence

2000

racine

300 250 200

0

1500

80

racine

0

1000

100

Distance, µm

0

500

racine

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

0

Distance, µm

racine

0

transect 5

80

100

transect 1

80 60 40 20 0

0

500

1000

1500

2000

Distance, µm

Figure 6. Distribution de K et Ca le long de la racine, en s’éloignant de l’apex (transect 1 à 5) et dans la rhizosphère (0 à 2000µm). 182

Zn

As

60 50 40 30 20 10 0

racine

transect 5

0

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence

60 50 40 30 20 10 0

Coup de fluorescence

racine

80 60 40 20 0

0

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

60 50 40 30 20 10 0

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

Coup de fluorescence Coup de fluorescence

60 50 40 30 20 10 0

80 60 40 20 0

500

1000 1500 Distance, µm

2000

transect 3

80 60 40 20 0

0

500

1000 1500 Distance, µm

2000

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

racine

transect 2

transect 2

100 80 60 40 20 0

0

500

racine

transect 1

500 1000 1500 Distance, µm

2000

Coup de fluorescence

racine

0

0

100

racine

0

2000

racine

transect 3

0

1000 1500 Distance, µm

transect 4

100

racine

60 50 40 30 20 10 0

500

racine

transect 4

Coup de fluorescence

racine

0

transect 5

100

1000 1500 Distance, µm

2000

transect 1

100 80 60 40 20 0

0

500

1000 1500 Distance, µm

2000

Figure 7. Distribution de Zn et As le long de la racine, en s’éloignant de l’apex (transect 1 à 5) et dans la rhizosphère (0 à 2000µm).

183